12.02.2010

Basisinfo

Mikrobielle Rekombinationssysteme

Gezieltes Ausschneiden von Genen

Rekombinationssysteme aus Bakterien und Hefen werden erfolgreich genutzt, um Markergene aus dem Genom transgener Pflanzen zu entfernen. Sie können auch dazu verwendet werden, Transgene aus dem Pollen zu entfernen und so die Ausbreitung der Transgene in die Umwelt zu verhindern.

Rekombination ist eine der Ursachen für die genetische Variabilität der Organismen. Bei diesem natürlichen Vorgang werden DNA-Abschnitte ausgetauscht und neu zusammengefügt. In Bakterien und Hefen wird die Rekombination unter anderem durch so genannte Rekombinationssysteme vermittelt. Diese bestehen aus zwei Komponenten:

• Rekombinase, einEnzym.
• bestimmte, als Sites bezeichnete Erkennungssequenzen: Die Rekombinase erkennt „ihre“ Sites und schneidet eine DNA-Sequenz, die dazwischen liegt, aus dem DNA-Strang heraus. Befinden sich an einer anderen Stelle des Genoms ebenfalls Sites, kann die Rekombinase die ausgeschnittene DNA-Sequenz dort wieder einbauen (homologe Rekombination).

Man kennt inzwischen mehrere natürlich vorkommende Rekombinationssysteme. Drei davon wurden bzw. werden in Projekten der Sicherheitsforschung verwendet:

• Das cre/loxP-System stammt aus dem Bakteriophagen P1. Es besteht aus der Rekombinase Cre und den lox-Sites.
• Das ebenfalls bakterielle Resolvase/res-System. Das Schneide-Enzym ist hier eine Resolvase, die dazu passenden Sites sind res-Sequenzen.
• Das FLP/FRT-System stammt aus einer Hefe. Die Erkennungssequenzen sind hier die FRT-Sites, die von der FLP-Rekombinase erkannt werden.

Bei den hier beschriebenen Verfahren werden die Rekombinationssysteme nur zum selektiven Ausschneiden von DNA-Abschnitten benutzt. Die ausgeschnittene DNA wird nicht an anderer Stelle wieder in das Pflanzengenom eingebaut, da keine Erkennungssequenzen vorliegen, sondern wird von zelleigenen Enzymen abgebaut.

Rekombinationssysteme zur Eliminierung von Markergenen. Zunächst werden transgene Pflanzen mit einem von den Sites eingerahmten Markergen hergestellt. Wenn das Markergen wieder entfernt werden soll, wird in die Pflanzen zusätzlich das Rekombinase-Gen eingeführt und das Markergen wird ausgeschnitten.

Es gibt zwei Möglichkeiten, die Rekombinase in die Pflanze einzubringen und auch wieder zu entfernen:

• Das Rekombinase-Gen wird nur vorübergehend in der Pflanze exprimiert (transiente Genexpression), ohne in das Pflanzengenom eingebaut zu werden. Dazu werden die Pflanzen mit gentechnisch veränderten Agrobakterien oder Viren infiziert, die das Rekombinase-Gen tragen. Viren werden bei der Samenbildung eliminiert, Agrobakterien werden überhaupt nicht auf die Nachkommen übertragen.
• Das Rekombinase-Gen wird zusammen mit dem Markergen, eingerahmt von den Sites, in das Pflanzengenom übertragen und zusammen mit dem Markergen wieder ausgeschnitten. Diese Vorgehensweise setzt voraus, dass man das Gen mit einem spezifischen Promotor versieht, um den Zeitpunkt des Ausschneidens steuern zu können.

Das cre-/loxP-System wurde in SiFo-Projekten bereits erfolgreich zur Markergen-Eliminierung bei Tabak, Zuckerrübe, Kartoffel, Raps und Weinreben eingesetzt. Bei Weinreben müssen allerdings noch die Bedingungen optimiert werden.

In einem abgeschlossenen SiFo-Projekt konnte die Funktionalität des Resolvase/res-Systems in Kartoffel-Protoplasten nachgewiesen werden. Außerdem wurde das System für die spezifischen Bedingungen bei Kartoffelpflanzen optimiert.

In einem weiteren abgeschlossenen SiFo-Projekt wurde das FLP/FRT-System erfolgreich zur Markergen-Eliminierung bei Pappel und Weizen eingesetzt.

Rekombinationssysteme zur Eliminierung von Transgenen aus Pollen (biologischer Einschluss oder Confinement). Hier geht man ähnlich vor wie bei der Markergen-Eliminierung, nur dass in diesem Fall das Zielgen, das die gewünschte Eigenschaft in der Pflanze vermittelt, von Sites eingeschlossen wird.

Das Rekombinase-Gen wird - zusammen mit Zielgen und Markergen - in das Pflanzengenom eingebracht. Es wird vorher mit einem Promotor versehen, der nur im sich entwickelnden Pollen aktiv ist. Nur dort wird das Rekombinase-Gen abgelesen und das Zielgen aus dem Genom herausgeschnitten. Die Vektoren werden so konstruiert, dass auch das Markergen und das Rekombinase-Gen mit ausgeschnitten werden.

Auf diese Weise erreicht man, dass eine transgene Pflanze transgen-freien Pollen bildet. So soll verhindert werden, dass Transgene sich durch Auskreuzung in der Umwelt ausbreiten.

In zwei aktuellen SiFo-Projekten werden das cre/loxP-System und das FLP/FRT-System eingesetzt, um Transgene aus den Pollen von Pappeln und Mais zu entfernen.

Nutzung von Rekombinationssystemen beim Gene targeting. Eine weitere wichtige Anwendung von Rekombinationssystemen ist das Gene targeting. Hier werden Rekombinationssysteme nicht zum Ausschneiden, sondern zum Einbau von DNA-Sequenzen genutzt. Die Erkennungssequenzen für eine Rekombinase werden in ein Pflanzengenom eingebracht und die Integrationsstelle wird zunächst mit molekulargenetischen Methoden charakterisiert. Anschließend kann mit Hilfe der Rekombinase jedes gewünschte Gen zielgerichtet in das Pflanzengenom integriert werden. Das Gene targeting kann mit der Entfernung eines Markergens kombiniert werden.