28.03.2006

Basisinfo

Markergen-Entfernung

Segregation: Zwei Gene rein, eins raus

Wenn Zielgen und Markergen an getrennten Orten in ein Pflanzengenom eingeschleust werden, kann man mit züchterischen Methoden Nachkommen erzeugen, die "markergen-frei" sind.

Der erste Schritt: Trennung von Zielgen und Markergen

Bei den klassischen Verfahren, mit denen Pflanzen gentechnisch verändert werden, sind das Zielgen, welches das gewünschte neue Merkmal vermittelt, und das Markergen aneinander gekoppelt. Sie werden in der Regel als Einheit an die Nachkommen weitergegeben.

Sind die beiden Gene jedoch an verschiedenen Orten im Pflanzengenom integriert, können sie in den Nachkommen dieser gentechnisch veränderten Pflanzen wieder getrennt werden. Diese enthalten dann entweder das eine oder das andere Gen.

Die Trennung von Ziel- und Markergen kann auf unterschiedliche Art und Weise erreicht werden: zum einen, indem man das Markergen mit Hilfe eines speziellen Enzyms, einer Transposase, an eine andere Stelle im Genom „springen“ lässt, zum anderen, in dem man die beiden Gene mit Hilfe zweier verschiedener T-DNAs überträgt (Co-Transformation), so dass sie unabhängig voneinander ins Pflanzengenom eingebaut werden.

Der zweite Schritt: Segregation

Bei der Segregation nutzt man die grundlegenden Vorgänge der Vererbung. Die meisten Pflanzen haben mindestens einen doppelten Satz an Chromosomen. Die neu eingeführten Transgene (Ziel- und. Markergen) werden jedoch in der Regel nur einfach eingebaut.

Die Keimzellen (Gameten) tragen nur noch einen einfachen Chromosomensatz. Bei der Bildung der Gameten werden die Chromosomen zufällig verteilt. Sind Ziel- und Markergen wie oben beschrieben voneinander getrennt worden, dann können die Keimzellen der transformierten Pflanzen entweder das Zielgen und das Markergen, beide oder keines von beiden enthalten. Bei den Nachkommen ist eine Vielzahl von Variationen möglich (siehe Schaubild). Statistisch werden 25% der Nachkommen das Markergen nicht mehr enthalten.

Auf diese Weise kann ein Markergen, das zunächst bei der Transformation das Auffinden erfolgreich transformierter Pflanzen erleichtert, nach „erledigter Arbeit“ wieder entfernt werden.

Eltern: Gameten (Keimzellen) besitzen nur einen einfachen Chromosomensatz. Er kann nur das Markergen (M, rot), das Zielgen (Z, grün), beide Gene oder keines davon tragen.

Nachkommen: Bei der geschlechtlichen Vermehrung vereinigen sich die Gameten der mütterlichen und der väterlichen Linie. Dabei ergänzen sich ihre jeweiligen Chromosomen zu einem doppelten Chromosomensatz.

In der Generation der Nachkommen sind verschiedene Kombinationen von Marker- und Zielgen möglich.

Mit denjenigen Pflanzen, die kein Markergen tragen (blau), kann weiter gezüchtet werden.

Erwünscht sind Pflanzen, die auf beiden Chromosomen das Zielgen tragen und gleichzeitig markergen-frei sind.

Für die Pflanzenzüchtung werden Pflanzen benötigt, die reinerbig sind, d.h. das Zielgen auf beiden Chromosomen des entsprechenden Chromosomenpaares tragen. Dadurch ist gewährleistet, dass in allen Nachkommen das Zielgen in jedem Fall vorhanden ist. Um reinerbige, markergenfreie transgene Pflanzen zu erhalten, müssen nach der Segregation der Transgene diejenigen Nachkommen gefunden werden, die auf beiden Chromosomen markerfrei sind, jedoch zweimal das Zielgen tragen. Diese Kombination kann mittels PCR- und Southern-Blot-Techniken identifiziert werden. Das ist aufwändig, da die gewünschte Kombination statistisch nur bei einem von sechzehn Nachkommen anzutreffen ist.

Es gibt Möglichkeiten, die Suche nach den gewünschten Nachkommen zu erleichtern. Eine davon ist die Kopplung des Markergens mit einem negativen Selektionsmarker . Durch die Zugabe einer so genannten Induktorsubstanz wird der negative Marker aktiv und alle Pflanzen, die ihn tragen, sterben ab. Übrig bleiben die Pflanzen, die kein Markergen tragen (im Schaubild blau umrandet). Unter ihnen enthält statistisch nicht nur jede sechzehnte, sondern jede vierte Pflanze wie gewünscht zwei Kopien des Zielgens, nicht aber das Markergen.

Eine weitere Möglichkeit, die gewünschten Nachkommen schneller zu identifizieren, ist die androgenetische Segregation . Dabei greift man in die Bildung der im Pollen entstehenden männlichen Keimzellen ein. Wird der noch unreife Pollen einem bestimmten Stress ausgesetzt, kann die normale Entwicklung zum reifen Pollen unterbrochen werden. Der Chromosomensatz kann - spontan oder auch künstlich ausgelöst - identisch verdoppelt werden.

Der Vorteil: In den aus diesen Zellen regenerierten Pflanzen gibt nur vier mögliche Genkombinationen (s. Schaubild). Auch hier trägt statistisch nicht nur jede sechzehnte, sondern jede vierte Pflanze die gewünschte Genkombination.

Keimzellen : Gameten (Keimzellen) besitzen nur einen einfachen Chromosomensatz. Er kann nur das Markergen (M, rot), das Zielgen (Z, grün), beide Gene oder keines davon tragen.

Regenerierte Nachkommen: Bei der androgenetischen Segregation regenerieren aus den Keimzellen Pflanzen mit identisch verdoppeltem Chromosomensatz. In diesen Pflanzen sind genau wie in den Keimzellen vier verschiedene Kombinationen von Marker- und Zielgen möglich. Diejenigen Pflanzen, die kein Markergen und zweimal das Zielgen tragen (blau umrandet), werden für die Sortenentwicklung benötigt.