Gezielter Einbau von Genen mittels Gene Targeting

(2005 – 2008) Universität Karlsruhe (TH), Botanisches Institut II

Thema

  • Durch ein bestimmtes Restriktionsenzym namens I-SceI kann im Pflanzengenom gezielt ein DNA-Bruch hervorgerufen werden, der sich anschließend durch homologe oder illegitime Rekombination wieder schließt. Wie im Vorläuferprojekt gezeigt wurde, können mit dieser Technik beispielsweise Markergene aus dem Genom transgener Pflanzen entfernt werden.
  • Über Homologien in einem vorhandenen DNA-Abschnitt kann gezielt DNA an diese Stelle im Pflanzengenom eingebaut werden ([[L:6|Gene Targeting]]).

Beide Ansätze, die gezielte Integration von Genen an einer bestimmten Stelle im Genom und die Entfernung des Markergens, sollen miteinander verknüpft werden. Ziel ist ferner die Etablierung eines effizienten und kultursortenunabhängigen Systems. Getestet wird dieses jedoch zunächst an den beiden Kulturarten Tabak und Arabidopsis thaliana.

Versuchsbeschreibung


In der Pflanze soll mittels Gene Targeting eine Gensequenz, die Targeting-Sequenz, gezielt in eine vorhandene Gensequenz, den Target Locus, integriert werden. Die Targeting-Sequenz ist die Sequenz zwischen den beiden I-SceI-Schnittstellen. Um das System zu testen, trägt er innerhalb der Schnittstellen in diesem Fall einen Teil des Kanamycin-Resistenzgens (KA). Außerhalb der Schnittstellen liegt zudem je ein Teil des GUS-Gens (blau), der für die spätere Farbreaktion von Bedeutung ist. Der Target Locus ist der Ziel-Integrationsort im Pflanzengenom und trägt den zweiten Teil des Kanamycin-Resistenzgens (rot, NA).

Um die Targeting-Sequenz gezielt in den Target Locus zu integrieren, werden folgende Schritte sowohl mit Tabakpflanzen als auch mit Arabidopsis thaliana durchgeführt:

(1) Herstellung unabhängiger transgener Pflanzenlinien

Zunächst werden der Targeting Vektor und der Target Locus in zwei unterschiedliche Pflanzenlinien transformiert:

  • Eine Pflanzenlinie trägt den Targeting Vektor. Dieser ist dabei von einem Farb-Markergen umschlossen, dem GUS-Gen. Damit kann später geprüft werden, ob die Targeting-Sequenz erfolgreich aus dem Genom der transgenen Pflanze herausgeschnitten wurde.
  • Die andere Pflanzenlinie trägt den Target Locus. Zusätzlich wird eine das Restriktionsenzym I-SceI kodierende Sequenz übertragen, welches später im generativen Gewebe der Pflanzen aktiv wird damit das Gene Targeting ermöglicht.

Mit Hilfe molekularbiologischer Methoden werden in beiden Pflanzenlinien diejenigen Pflanzen ausgesucht, die das jeweilige Transgen nur einmal in ihr Genom integriert haben.

(2) Kreuzung der beiden Pflanzenlinien

Beide Pflanzenlinien werden miteinander gekreuzt. Die Nachkommen werden zum Teil auf kanamycinhaltigem Boden ausgesät und auf ihre Resistenz hin überprüft. Pflanzen, die auf diesem Nährboden überleben, besitzen das Resistenzgen. Bei diesen war das Gene Targeting erfolgreich.

Ein zweiter Teil der Pflanzen wird auf einem Medium ohne Kanamycin ausgesät. Mit einer Farbreaktion werden die Pflanzen bestimmt, die die Targeting-Sequenz erfolgreich herausgeschnitten und das GUS-Gen repariert haben.

Das Verhältnis der Anzahl der Pflanzen, aus denen die Targeting-Sequenz erfolgreich herausgeschnitten wurde, zu den Pflanzen, bei denen das Kanamycin-Resistenzgen erfolgreich restauriert wurde, gibt Auskunft über die Effizienz des Gene Targeting-Systems.

(3) Überprüfung der Orte der homologen Rekombination

Die Pflanzen, in denen das Kanamycin-Resistenzgen erfolgreich restauriert wurde, werden weiter molekularbiologisch untersucht um festzustellen, ob die Targeting-Sequenz vollständig in den Target Locus integriert wurde.

Ergebnisse

(1) Herstellung unabhängiger transgener Pflanzenlinien

Im ersten Projektjahr (2005) wurden die Konstrukte Targeting Vektor und Targeting Locus hergestellt. Mittels Agrobakterien wurden sie in Tabakpflanzen und Arabidopsis thaliana eingebracht. In der ersten Nachkommenschaft der beiden Organismen konnten diese Konstrukte bereits identifiziert werden.

Im folgenden Jahr (2006) wurden weitere Pflanzen transformiert. Das Saatgut dieser Pflanzen wurde solange kultiviert und selektiert, bis das jeweilige Transgen nur einmal im Genom vorhanden war. Für Tabak konnten sechs Linien mit dem Targeting Vector und fünf mit dem Targeting Locus identifiziert werden, bei Arabidopsis enthielten jeweils vier Linien eins der beiden Konstrukte.

Die Blaufärbung der jungen Arabidopsis- Pflanzen (ca. vierzehn Tage jung) zeigt eine erfolgreiche Rekombination an. Die Targeting-Sequenz wurde herausgeschnitten und damit das an der Farbreaktion beteiligte GUS-Gen repariert.

Grafik und Fotos: Prof. H. Puchta, Universität Karlsruhe

Anschließend wurde in alle Targeting Locus-Linien das Gen mit der I-SceI kodierenden Sequenz eingebracht. Bei Arabidopsis wurde die Gensequenz unter die Kontrolle von jeweils drei verschiedenen Promotoren gestellt. In Tabak kamen I-SceI-Konstrukte mit zwei verschiedenen Promotoren zum Einsatz. Diese erneut transformierten Linien werden zur Zeit daraufhin geprüft, ob die I-SceI kodierenden Sequenz nur einmal im Genom vorhanden ist.

Parallel zu diesen Arbeiten wurde in den Targeting Locus-Linien von Arabidopsis und Tabak auch ein induzierbares Promotorsystem getestet. Für Arabidopsis konnte aber gezeigt werden, dass dieser Promotor auch ohne äußere Einflüsse die Expression des I-SceI-Gens hervoruft. Dieses System wurde daraufhin für ein Gene Targeting verworfen.

Zudem wurde damit begonnen, in Arabidopsis mittels PCR die Orte, an denen der Targeting-Vector bzw. -Locus im Genom eingefügt wurden, zu bestimmen.

(2) Kreuzung der beiden Pflanzenlinien.

Im dritten Projektjahr (2007) wurden Tabak- bzw. Arabidopsis-Pflanzen, welche die Konstrukte Targeting Vektor bzw. Targeting Locus mit der molekularen Schere I-SceI enthielten, miteinander gekreuzt.

Für die Nachkommen der gekreuzten Arabidopsis-Linien konnte bereits gezeigt werden, dass die Targeting-Sequenz aus dem Targeting Vektor herausgeschnitten und dieser durch homologe Rekombination repariert wurde, was durch Blaufärbung der entsprechenden Pflanzen gezeigt werden konnte.