19.06.2009

Forschung Projekte

Transgene pilzresistente Apfelbäume – Auswirkungen auf pathogene und nützliche Pilze

(2005 – 2010) Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH, Department Bodenökologie

Thema

Im Mittelpunkt stehen gentechnisch veränderte Apfelbäume mit erhöhter Pilzresistenz. Die transgenen Gehölze bilden zwei zusätzliche Proteine, die die Auflösung pilzlicher Hyphenwände bewirken. Welchen Einfluss hat die gentechnische Veränderung auf parasitische und nützliche Pilze, insbesondere auf Mykorrhizapilze, die mit den Bäumen in Symbiose leben und deren Wurzeln besiedeln?

Symbiosen mit Mykorrhizapilzen spielen eine zentrale Rolle für die Ernährung der Pflanzen. Auf Apfelbäumen findet man arbuskuläre Mykorrhizapilze (AM). Aus Modellversuchen mit anderen Pflanzen ist bekannt, dass verschiedene AM-Pilze funktionell nicht gleichwertig und in ihrer Leistung für die Pflanze deshalb nicht austauschbar sind. Die Vielfältigkeit (Diversität) von Mykorrhizen ist somit ein wichtiger Faktor für die Produktivität von Ökosystemen.

Folgende Fragestellungen sind von Interesse:

• Führt die Expression der Resistenzgene zu Änderungen in der Mykorrhizierungsrate und Zusammensetzung der Pilz-Gemeinschaften?
• Wenn ja, treten diese Effekte nur bei transgenen Pflanzen auf, die Chitinase in der Wurzel produzieren oder hat auch schon die Pfropfung eines transgenen Edelreisers auf eine Wildtyp-Pflanze einen Einfluss auf die Mykorrhizierung an der Wurzel?

Versuchsbeschreibung

Pflanzenmaterial

Der Pinova-Wildtyp und zwei transgene Linien, die jeweils zwei Schädlingsresistenz-Gene exprimieren wurden in vitro vermehrt und bewurzelt. Weiterhin wurden Edelreiser (einjährige Triebe) des Wildtyps und der transgenen Linien auf nicht transgene Unterlagen der Sorte M9 gepfropft. Unterlagen sind Pflanzen, welche die Wurzeln und einen Teil des Stammes liefern.

Alle benötigten Pflanzen wurden am Institut für Obstzüchtung (BAZ) in Dresden-Pillnitz in den dortigen Gewächshäusern kultiviert. Zusätzlich steht Wildtyp-Referenzmaterial aus den Versuchsfeldern im Freiland zur Verfügung.

Verwendete Gene zur Verbesserung der Resistenz gegenüber Schadpilzen

Die transgenen Gehölze bilden zwei verschiedene Chitinasen. Diese Enzyme bewirken den gezielten Abbau von Chitin, dem wichtigsten Bestandteil pilzlicher Hyphenwände. Die entsprechenden Gene werden in allen Pflanzenteilen und zeitlich unbegrenzt exprimiert. Sie stammen aus einem Pilz (Trichoderma atroviride), der unter natürlichen Bedingungen große Mengen an Chitinasen bildet. Der Pilz wird bei der Eindämmung des Apfelschorf-Erregers (Venturia inaequalis) eingesetzt, der die Blätter von Apfelbäumen befällt.

Untersuchungen zu Auswirkungen auf die Mykorrhizabildung in Gewächshaus und Freiland

Es sollen sowohl die Mykorrhizapilze quantifiziert als auch die Diversität der Mykorrhiza-Gemeinschaften ermittelt werden. Hier interessiert die Frage, ob die Mykorrhiza-Bildung durch die Transgene beeinflusst wird. Freiland- und Gewächshausergebnisse sollen miteinander verglichen werden.

Mikroskopische Beobachtung der Mykorrhizierungsrate: Die quantitative Bestimmung der Wurzelkolonisierung (Mykorrhizierungsrate) erfolgt durch mikroskopisches Auszählen von AM-Strukturen. Dazu werden die Wurzelproben mit speziellen Methoden angefärbt.

Identifizierung dominierender AM-Pilze mit molekularbiologischen Methoden: Die molekularbiologische Bestimmung der AM-Pilze erfolgt über den PCR-Nachweis.

Ergebnisse

Auswirkungen der gentechnischen Veränderung auf die Mykorrhiza-Bildung

Die transgenen Linien der Sorten Remo und Pinova wurden auf ihre Resistenz gegenüber dem Erreger des Apfelschorfs (Venturia inaequalis) getestet. Die Sorte Remo und die dazugehörige transgene Linie überstanden die Bedingungen des Resistenztests nicht und schieden aus den weiteren Versuchen aus. Mehrere transgene Linien der Sorte Pinova zeigten eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber dem Schadpilz.

Zwei der transgenen Linien von Pinova sowie der Pinova-Wildtyp wurden ausgewählt und zum einen in vitro vermehrt und bewurzelt, zum andern als Edelreiser auf die Unterlage M9 gepfropft.

Um die Auswirkungen der gentechnischen Veränderung auf die Mykorrhizierung untersuchen zu können, wurden mehrere Experimente durchgeführt.

• Einige Versuchspflanzen konnten im Frühsommer 2006 mit Freilandboden eines Apfelstandortes versehen und in einem Freilandkäfig kultiviert werden.
• 2007 wurden 63 Apfelbäume (Pinova Wildtyp und zwei transgene Linien, sowohl auf eigener Wurzel als auch gepfropft auf die Unterlage M9) in Gewächshaus-Substrat herangezogen und mit den AM-Arten Glomus intraradices und G. mosseae geimpft. Die Versuchspflanzen wurden im Herbst 2007 und im Herbst 2008 beprobt.

Um den Einfluss der gentechnischen Veränderung auf die Diversität der Mykorrhiza-Pilze untersuchen zu können, wurde im Frühjahr 2008 ein weiteres Gewächshaus-Experiment angesetzt. 110 Apfelbäume (Pinova Wildtyp und zwei transgene Linien, auf eigener Wurzel) wurden in Töpfen mit Boden von zwei unterschiedlichen Standorten - einer intensiv bewirtschafteten Apfelplantage und einer Streuobstwiese - kultiviert. Die Versuchspflanzen wurden im Sommer und Herbst 2008 beprobt. Weiterhin wurden im Verlauf der Vegetationsperiode 2006 an sechs Freilandstandorten Wurzelproben genommen, um das natürliche Spektrum der mit Apfelbäumen assoziierten AM-Pilze zu erfassen. Nachdem die mikroskopischen Untersuchungen (Mykorrhizierungsraten) für alle Versuche abgeschlossen sind, liegt der Fokus der aktuellen Projektphase auf dem Abschluss der molekularbiologischen Analysen (Diversität der Mykorrhiza-Pilze, Gen-Expression, Enzym-Aktivität).