11.12.2008

Forschung Projekte

Herstellung eines Bt-Toxin-Standards (Cry3Bb1) und Entwicklung von Nachweismethoden

(2005 – 2008) Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum (DLR) Rheinpfalz, Neustadt a. d. Weinstr.

Thema

Für den Projektverbund zu Diabrotica-resistentem Bt-Mais wurde zentral

• standardisiertes Bt-Toxin (Cry3Bb1) hergestellt
• eine einheitliche Messmethode entwickelt und etabliert, mit der die jeweilige Menge des in den Maispflanzen gebildeten Bt-Toxins erfasst werden kann.

Ein Bt-Toxin-Standard und eine einheitliche Methode zum quantitativen Nachweis des Toxins sind notwendig, damit die Ergebnisse der verschiedenen Teilprojekte vergleichbar sind.

Der produzierte Bt-Toxin-Standard wurde den anderen Teilprojekten des Verbundes zur Verfügung gestellt.

Versuchsbeschreibung

Herstellung eines Cry3Bb1-Toxin-Standards

Zunächst wurde ein Bt-Toxin-Standard hergestellt. Dazu wurde das Cry3Bb1-Gen aus dem transgenen Mais Mon88017 isoliert und zur Produktion des Bt-Proteins in E. coli eingebaut.

Im November 2005 wurde von der Firma Monsanto zusätzlich ein Expressions-Plasmid mit dem Cry3Bb1-Gen zur Verfügung gestellt.

Die Reinigung des Cry3Bb1-Proteins wurde optimiert.

Charakterisierung des Toxin-Standards

Die bakteriell und pflanzlich produzierten Bt-Toxine wurden hinsichtlich ihres Molekulargewichtes und immunologisch charakterisiert, um sicherzustellen, dass der weiter verwendete Toxin-Standard mit dem in den Pflanzen vorkommenden Protein identisch ist.

Zusätzlich wurden die Bt-Toxine auch auf ihre biologische Aktivität in einem Bioassay mit dem Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata) untersucht. Der Versuch wurde am Institut ART (Zürich, Schweiz) durchgeführt.

Entwicklung eines Nachweises von Cry3Bb1

Für Cry3Bb1 gibt es noch keine kommerzielle quantitative Messmethode. Einer der verfügbaren qualitativen Nachweise wurde für einen quantitativen Nachweis optimiert und etabliert.

Zusätzlich wurde ein neuer quantitativer Nachweis entwickelt.

Nachweis von Cry3Bb1 in Pflanzenmaterial

Zu vier Entwicklungsstadien (BBCH 21, 30, 63 und 83) wird am Freisetzungsstandort des Verbundes Pflanzenmaterial (Wurzel, Stängel, unteres und oberes Blatt, Antheren (Staubbeutel), Fruchtfäden und Kolben bzw. Körner) entnommen und auf Cry3Bb1-Expression analysiert.

Es wurden die Frisch- und Trockengewichte der Proben bestimmt.

Ergebnisse

Herstellung eines Cry3Bb1-Toxin-Standards

Insgesamt wurden den Projektpartnern 220 Milligramm Toxin zur Verfügung gestellt. Seit 2007 kann das Toxin mit einem Reinheitsgrad von 85 Prozent produziert werden.

Charakterisierung des Toxin-Standards

Beide zur Verfügung stehenden Cry3Bb1-Gene wurden in E. coli eingebaut und das Cry3Bb1-Protein hergestellt. Mit beiden Genen wurde ein Bt-Protein der gleichen Größe (77 Kilo Dalton) aus E. coli isoliert.

Das Protein kann bei minus zwanzig und minus achtzig Grad Celsius über neun Monate lang stabil gelagert werden.

Die Bioassays haben gezeigt, dass die untersuchten Bt-Toxine eine vergleichbare Toxizität besitzen.

Entwicklung eines Nachweises von Cry3Bb1

Bei dem zum quantitativen Nachweis optimierten ELISA-Nachweis wurde eine Nachweisgrenze von 0,2 Nanogramm erreicht. Dieser Test wurde für die quantitative Bestimmung der Cry3Bb1-Expression im Freiland verwendet.

Mit dem neu entwickelten Nachweis kann Cry3Bb1 aus Extrakten der Bt-Maiskörner, gemischten Maisproben sowie aus E. coli im Western Blot nachgewiesen werden.

Nachweis von Cry3Bb1 in Pflanzenmaterial

Insgesamt wurden in den drei Versuchsjahren 2005-2007 fast tausend Gewebeproben entnommen und ihre Cry3Bb1-Gehalte bestimmt.

Die Cry3Bb1-Gehalte in oberen Blättern waren höher als in Wurzeln, unteren Blättern, Antheren und Körnern (23 - 34 µg/g Frischgewicht). In den Kolben fand sich die niedrigste Konzentration von Cry3Bb1-Toxin. In den Antheren konnte fast so viel Cry3Bb1-Toxin wie in den oberen Blättern und 1,5 mal so viel wie in den Fruchtfäden nachgewiesen werden. Dabei nahmen die Cry3Bb1-Gehalte zu den späteren Entwicklungsstadien hin ab. Dies wird deutlich, wenn die Toxin-Gehalte auf das Trockengewicht bezogen werden. Die Schwankungen der Toxin-Gehalte von Pflanze zu Pflanze waren nicht hoch.