20.03.2009

Forschung Projekte

Verbleib des Bt-Proteins (Cry3Bb1) im Boden

(2005 – 2008) Institut für angewandte Biotechnologie der Tropen an der Universität Göttingen (IBT)

Thema

In diesem Projekt wurde untersucht, wie sich die Freisetzung gentechnisch veränderter Bt-Maissorten (Cry3Bb1) auf die Böden der Freisetzungsfläche auswirkt. Im Vorläuferprojekt hatte sich gezeigt, dass ein enger Zusammenhang zwischen den Oberflächeneigenschaften der Böden und der Bindung des Bt-Proteins (Cry1Ab) in Böden besteht.

Daher wurden

• die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Böden des Standortes untersucht
• das Bindungsverhalten und die Verlagerung des Bt-Toxins im Hinblick auf die Bodeneigenschaften bestimmt.

Zusammenfassung

Die Böden des Freisetzungsstandortes waren durch eine starke Heterogenität gekennzeichnet. Dennoch konnten folgende Aussagen zur Bedeutung der Böden erarbeitet werden:

Charakterisierung des Bodens

Der Stickstoffgehalt der Böden der Bt-Mais-Parzellen unterschied sich nicht von den Böden der konventionellen bzw. isogenen Parzellen. Der Gehalt an organischer Substanz der Tonfraktion der Oberböden zeigte innerhalb des Versuchsfeldes keine starke Streuung. Die Schwankungen der Kationenaustauschkapazität (KAK) innerhalb der Freisetzungsfläche wurde auf die chemisch-mineralogische Zusammensetzung der Tonfraktion zurückgeführt.

Bindung von Cry3Bb1

Cry3Bb1 bindet stärker an die Tonfraktionen der untersuchten Parzellen als Cry1Ab. Im Oberboden wurde das Cry3Bb1-Protein stärker an die Tonfraktion gebunden als in den Unterböden. Weiterhin zeigten die Unterböden mit zunehmendem Gehalt an Manganoxiden eine größere Affinität gegenüber Cry3Bb1. Aufgrund der Heterogenität des Bodens zeigten alle Proben aus der Tonfraktion ein ganz unterschiedliches Bindungsverhalten gegenüber Cry3Bb1.

Bestimmung der Verlagerung des Cry3Bb1-Toxins im Boden

Aufgrund der Ergebnisse aus den Verlagerungsexperimenten mit Cry3Bb1 in einem Konzentrationsbereich, der für das Feld relevant ist, wird mit einer Verlagerung von Cry3Bb1 in bindungsschwachen Böden gerechnet. Art und Höhe der Verlagerung sind jedoch von der Stabilität der Cry-Proteine, den Eigenschaften der Böden und der mikrobiellen Aktivität in den jeweiligen Böden abhängig.

Versuchsbeschreibung

Charakterisierung des Standortes

Am Freisetzungsstandort des Verbundes wurden im Rahmen der bodenkundlichen Kartierung von allen 32 Parzellen Bodenproben in den Tiefen von 0 bis 20 Zentimeter (Oberboden) und 40 bis 60 Zentimeter (Unterboden) entnommen. Aus diesen Bodenproben wurden die Tonfraktion (< 2 µm) und die Feinerde (< 2 mm) gewonnen. Diese wurden bodenkundlich charakterisiert und hinsichtlich ihres Bindungsverhaltens untersucht.

Zusätzlich wurden an drei markanten Standorten der Freisetzungsfläche Bodenprofile entnommen (s. Abb.). Da der Mais zum Zeitpunkt der Probennahme bereits ausgesät war, wurden diese Profile außerhalb der Parzellen angelegt.

Zur Charakterisierung der Böden werden folgende Eigenschaften untersucht:

• bodenkundliche Kenndaten wie z.B. pH-Wert, C/N-Verhältnis, Gehalt an organischer Substanz sowie Korngrößenverteilung und Porengrößenverteilung. Mit der Korngrößenverteilung wurden die Gehalte an Ton, Schluff und Sand ermittelt. Außerdem wurde die Kationenaustauschkapazität (KAK, Maß für die austauschbaren positiv geladenen Teilchen) der Proben bestimmt.
• die chemisch-mineralogische Zusammensetzung der Tonfraktion
• die Oberflächeneigenschaften der Bodenpartikel wie z.B. Oberflächenladung und spezifische Oberfläche.

Bindung von Cry3Bb1 und Reversibilität der Bindung

Zur Bestimmung der Bindung des Cry3Bb1-Proteins an unterschiedliche Bodenfraktionen wurden Ton- bzw. Feinerde-Proben mit Cry3Bb1-Protein (0 bis 140 ng/ml) versetzt. Die Cry3Bb1-Konzentrationen des nicht gebundenen Bt-Proteins wurden nach 30 Minuten mittels ELISA bestimmt. Die Untersuchungen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, um den mikrobiologischen Abbau des Cry3Bb1 während der Bindungsuntersuchungen auszuschließen.

Außerdem wurde untersucht, inwieweit die Temperatur, der pH-Wert und unterschiedliche Kationen (Natrium, Calcium, Magnesium) die Bindung des Cry3Bb1-Proteins an den Bodenfraktionen beeinflussen.

Zusätzlich wurde auch das Bindungsverhalten von Cry3Bb1 und Cry1Ab verglichen.

Bestimmung der Verlagerung des Cry3Bb1-Proteins im Boden

Um die Verlagerung des Cry3Bb1-Proteins in den Böden der Freisetzungsfläche näher zu charakterisieren, wurde eine Säule mit Feinerde aus dem Unterboden der Bodenprofile gefüllt und das Verhalten des Cry3Bb1-Proteins in dem Boden beobachtet.

Ergebnisse

Charakterisierung des Standortes

Stickstoffgehalt. Um einen möglichen Einfluss von mehrjährigem Bt-Maisanbau auf die Mineralisierung der Streu feststellen zu können, wurde der Gehalt an pflanzenverfügbaren Formen des Stickstoffs (N_min) der Freisetzungsfläche bestimmt. Die N_min- Werte der Böden der Bt-Mais-Parzellen unterschieden sich nicht von denen der Böden der konventionellen bzw. isogenen Parzellen. 2007 waren die Werte insgesamt niedriger, da der Eintrag von Ernteresten durch die Verarbeitung der Maispflanzen zu Maissilage verringert war.

Korngrößenverteilung. Die Tongehalte der Oberböden (0-20 cm) lagen bei acht bis zehn Prozent und zeigten innerhalb des Versuchsfeldes keine starke Streuung. Im Unterboden waren die Tongehalte geringfügig höher als im Oberboden. In einigen Parzellen lagen sehr hohe Tongehalte (30-40 %) im Unterboden vor. Allgemein waren in allen Parzellen die Sandgehalte höher als die Schluffgehalte.

Der Gehalt an organischer Substanz der Tonfraktion der Oberböden lag in einem für Ackerböden typischen Bereich von 2,1 bis 3,3 Prozent und zeigte im Oberboden innerhalb des Versuchsfeldes keine starke Streuung.

Die Kationenaustauschkapazität (KAK) der Feinerde der Oberböden zeigte eine geringe Streuung innerhalb des Versuchsfeldes. Die Unterböden der Parzellen mit hohem Tongehalt zeigten eine höhere KAK mit stärkerer Streuung.

Im Unterboden mit einem geringeren Gehalt an organischer Substanz, war der Tongehalt – im Gegensatz zum Oberboden – stark mit der KAK korreliert. Die KAK der Tonfraktion des Ober- und des Unterbodens war wesentlich höher als die der Feinerde. Die starke Schwankung der KAK innerhalb der Freisetzungsfläche wurde auf die chemisch-mineralogische Zusammensetzung der Tonfraktion zurückgeführt.

Die pH-Werte der Böden lagen typisch für einen Acker zwischen 5,0 bis 6,0. Die Oberböden zeigten jedoch geringere pH-Werte als die Unterböden, was auf eine von oben nach unten fortschreitende Versauerung zurückzuführen ist.

Spezifische Oberfläche und Oberflächenladung. Die spezifische Oberflächengröße sowie die negative Oberflächenladung im Oberboden werden sowohl durch den Tongehalt als auch durch den Gehalt der organischen Substanz beeinflusst. Aufgrund der Homogenisierung durch Pflugbearbeitung waren keine signifikanten Unterschiede innerhalb der Reihen und der Parzellen zu erkennen. Im Unterboden wurde ein deutlicher Zusammenhang zwischen Tongehalt der Feinerde und der Oberflächengröße sowie der negativen Oberflächenladung beobachtet. Daher variieren beide Oberflächenwerte im Unterboden wegen der unterschiedlichen Tongehalte stärker. Aufgrund ihrer Partikelgröße zeigten die Bestandteile der Tonfraktion eine größere spezifische Oberfläche als diejenigen der Fraktion < 2 mm.

In der chemisch-mineralogischen Untersuchung wurde der Gehalt an Eisen- und Manganoxiden und -hydroxiden bestimmt. Aus den Mengenverhältnissen der Eisenoxide ist ein Rückschluss auf das Bodenalter und die Kristallisationsbedingungen möglich.

Bindung von Cry3Bb1 und Reversibilität der Bindung

Es konnte gezeigt werden, dass die Menge an gebundenem Cry3B1-Protein linear zunimmt, wenn die Cry3Bb1-Protein-Konzentration in der Lösung, die man dem Ton hinzufügt, erhöht wird (Abb.1). Cry3Bb1 bindet stärker an die Tonfraktionen der untersuchten Parzellen als Cry1Ab (Abb.2). Die Gründe für dieses unterschiedliche Verhalten der Cry-Proteiene sind derzeit unklar. Es wird jedoch vermutet, dass nicht nur die Eigenschaften der Bodenbestandteile, sondern auch der strukturelle, chemische Aufbau der Cry-Proteine einen erheblichen Einfluss auf die Bindung der Cry-Proteine hat.

Im Oberboden wurde das Cry3Bb1-Protein stärker an die Tonfraktion gebunden als in den Unterböden. Weiterhin zeigten die Unterböden mit zunehmendem Gehalt an Manganoxiden eine größere Affinität gegenüber Cry3Bb1. Innerhalb der Reihen waren nur geringe Unterschiede im Bindungsverhalten der Tonfraktion des Oberbodens erkennbar. Die Probe aus einer Parzelle zeigte eine deutlich geringere Affinität gegenüber Cry3B1b.

Einfluss der bodenkundlichen Daten auf die Bindung. Aufgrund der unterschiedlichen Streubereiche zwischen Ober- und Unterboden wird angenommen, dass eine unbekannte Variable, die sich zwischen Ober- und Unterboden unterscheidet, einen wesentlichen Einfluss auf die anderen Variablen hat.

Bestimmung der Verlagerung des Cry3Bb1-Toxins im Boden

In Säulenversuchen, in denen Feinerde eingesetzt wurde, konnte in der durchgelaufenen Lösung Cry3Bb1 nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass eine Verlagerung von Cry3Bb1 in bindungsschwachen Böden möglich ist. Art und Höhe der Verlagerung sind jedoch ganz stark von der Stabilität der Cry-Proteine, der Eigenschaften der Böden sowie der mikrobiellen Aktivität in den Böden abhängig.

Die Verlagerungsversuche von Cry3Bb1 erfolgten mit Konzentrationen, die auch im Feld vorkommen. Das Cry3Bb1 konnte in der durchgelaufenen Lösung nachgewiesen werden. Nach ca. 1,5 Porenvolumen erfolgte eine Abnahme der Cry3Bb1-Konzentration, die möglicherweise auf einen mikrobiellen Abbau des Cry3Bb1-Proteins in der Säule zurückzuführen ist.