Entwicklung der Plastidentransformation für Mais

(2008 – 2011) Lehrstuhl für Genetik - Forschungsdepartment für Pflanzenwissenschaften - Wissenschaftszentrum Weihenstephan Technische Universität München

Thema

Neue Forschungsansätze zielen darauf ab, Pflanzen nicht im Zellkern, sondern in den Plastiden gentechnisch zu verändern. Plastiden sind kleine Einheiten in der Pflanzenzelle, die über eigene DNA verfügen. Einer der Vorteile der Plastidentransformation: Die Erbinformation der Plastiden wird nicht über den Pollen weitergegeben, eine mögliche Ausbreitung der neu eingebrachten Gene damit verhindert und das Erbgut in der Pflanze biologisch eingeschlossen (biologisches Confinement).

Ziel des vorliegenden Projektes ist es, die Plastidentransformation für die Kulturpflanze Mais zu etablieren. Diese soll auf Basis der biolistischen Transformation (Partikelbeschuss) von Mais-Embryonen erfolgen.

Informationen zum Verfahren:

Das Projekt ist Teil des Verbundprojektes CONFICO „Entwicklung und Prüfung von Plastidentransformation als Confinement-System bei Raps und Mais“. Beteiligt sind der Lehrstuhl für Botanik (Prof. Dr. Dario Leister), der Arbeitsgruppe für Zellbiologie und Zellkultur (Prof. Dr. Hans-Ulrich Koop) der Universität München, der Lehrstuhl für Genetik (Prof. Dr. Alfons Gierl) der Technischen Universität München und der Lehrstuhl für Agrobiotechnologie (Prof. Dr. Inge Broer) der Universität Rostock.

Versuchsbeschreibung

Für eine erfolgreiche Etablierung der Plastidentransformation bei Mais sind wichtige Vorarbeiten zu leisten. Um eine stabile Genintegration in den Plastiden möglichst effizient zu garantieren, sind folgende Arbeitsschritte zu optimieren:

  • Anzucht von geeignetem Pflanzengewebe für die Transformation. Maisembryonen haben sich als geeignetes Gewebe für eine Transformation und Regeneration erwiesen. Im Vorfeld sind geeignete Spenderpflanzen für Maisembryonen auszuwählen und anzuziehen.
  • Isolierung von zygotischen Maisembryonen. Embryonen eignen sich als sich schnell teilendes Gewebe sehr gut für die Transformation und Regeneration neuer Pflanzen. Während der Embryonenentwicklung ist das optimale Stadium für die Transformation zu bestimmen.
  • Optimierung der "biolistischen" Transformation. Eine Optimierung der technischen Umsetzung der Transformation wie z.B. des Abstandes der Partikel-Kanone zum Gewebe, der verwendeten DNA-Menge, des ausgeübten Drucks und der Partikelgröße ist notwendig.
  • Regeneration und Anzucht der transformierten Mais-Linien. Das transformierte Gewebe wird keimfrei in Kulturschränken angezogen und bei entsprechender Größe ins Gewächshaus ausgepflanzt.

Die Selektion erfolgreich und stabil transformierter Pflanzen erfolgt in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Koop.

Ergebnisse

Mais-Embryo

Zygotische Maisembryonen die aus dem Kolben isoliert wurden. Die 1,5 bis zwei Millimeter großen Embryonen eignen sich für die Transformation mit der Partikel-Kanone.

transgener Kallus

Maiskallus, der sich auf geeignetem Nährmedium aus den Embryonen bildet.

Aus den Kolben der Mais-Spenderpflanzen wurden zygotische Maisembryonen isoliert.

Nach ein bis zwei Wochen bei 28 Grad Celsius im Dunklen auf einem Nährmedium erfolgte die Transformation der Embryonen durch Beschuss mit der Partikel-Kanone. Durch eine Vielzahl an Versuchen wurden die geeigneten Parameter für die biolistische Transformation gefunden.

Anschließend wurden die transformierten Embryonen für ein bis zwei Wochen auf ein Nährmedium, das die Kallus-Bildung fördert, gesetzt. Zur Selektion des transformierten Kallus wurden verschiedene Antibiotika-haltige Medien (Kanamycin, Amikacin, Geneticin, Spektinomycin, Streptomycin) getestet. Die optimalen Bedingungen erwiesen sich bei einer Selektion mit Kanamycin, bei 28 Grad Celsius im Dunkeln und zygotischen Embryonen als Ausgangsmaterial. Im nächsten Schritt sollen aus dem Kallus-Material Pflanzen angezogen werden.