10.11.2010

Forschung Projekte

Erzeugung transplastomischer Raps- und Maislinien

(2008 – 2011) Zellbiologie und Zellkultur, Bereich Botanik, Dept. I, Fakultät für Biologie, Ludwig-Maximilians-Universität (LMU) München

Thema

Neue Forschungsansätze zielen darauf ab, Pflanzen nicht im Zellkern, sondern in den Plastiden gentechnisch zu verändern. Plastiden sind kleine Einheiten in der Pflanzenzelle, die über eigene DNA verfügen. Einer der Vorteile der Plastidentransformation: Die Erbinformation der Plastiden wird in der Regel nicht über den Pollen weitergegeben, eine mögliche Ausbreitung der neu eingebrachten Gene damit weitestgehend verhindert und das Erbgut in der Pflanze biologisch eingeschlossen (biologisches Confinement).

Die Ausbreitung der Plastiden-DNA über den Pollen kann jedoch nicht zu hundert Prozent ausgeschlossen werden. In anderen Forschungsarbeiten wurden zwei Prozesse ermittelt, die möglicherweise die Sicherheit dieser Methode einschränken:

  • eine gelegentliche väterliche Vererbung (paternal leakage) der Plastiden
  • sowie ein Gentransfer aus dem Plastidengenom in das Kerngenom der Pflanzen.

Ziel dieses Projektes ist es, langfristig die Bedeutung dieser beiden Prozesse an Nutzpflanzen und unter Feldbedingungen zu quantifizieren. Hierzu sollen durch Plastidentransformation geeignete Linien der Kulturpflanzen Raps und Mais erzeugt werden.

Informationen zum Verfahren:

Das Projekt ist Teil des Verbundprojektes CONFICO „Entwicklung und Prüfung von Plastidentransformation als Confinement-System bei Raps und Mais“. Beteiligt sind der Lehrstuhl für Botanik (Prof. Dr. Dario Leister), der Arbeitsgruppe für Zellbiologie und Zellkultur (Prof. Dr. Hans-Ulrich Koop) der Universität München, der Lehrstuhl für Genetik (Prof. Dr. Alfons Gierl) der Technischen Universität München und der Lehrstuhl für Agrobiotechnologie (Prof. Dr. Inge Broer) der Universität Rostock.

Versuchsbeschreibung

Etablierung der Plastidentransformation bei Raps und Mais

Die Plastidentransformation ist für einige Kulturarten entwickelt, steht jedoch für wichtige Nutzpflanzenarten wie Mais und Raps noch nicht zur Verfügung. Aufbauend auf Vorarbeiten der Arbeitsgruppe insbesondere zu Raps sollen transplastomischer Raps und, in Zusammenarbeit mit der Forschungsgruppe Gierl, TU München, transplastomische Maislinien hergestellt werden.

Für eine erfolgreiche Etablierung der Plastidentransformation sind im vorliegenden Projekt folgende Arbeitsschritte vorgesehen:

  • Die Prüfung geeigneter Gewebeteile (z.B. Keimblätter, Hypokotyl oder Protoplasten) von Raps und Mais (unreife Embryonen) auf ihre Tauglichkeit für eine Transformation und auf ihre Fähigkeit zur Regeneration.
  • Die Erzeugung von transplastomischen Linien bei Mais und Raps und deren molekularbiologische Charakterisierung. Die Transformationen sollen vor allem mit der biolistischen Methode (Partikelkanone) durchgeführt werden.
  • Die Herstellung spezieller Transformationskassetten (Transformationsvektoren). Um die Eignung der Plastidentransformation als biologisches Confinement-System zu überprüfen, werden die Transformationsvektoren für die Plastiden mit Markergenen ausgestattet. Die Transformationsvektoren enthalten sowohl ein Markergen (z.B. Antibiotikaresistenz), welches eine mögliche väterliche Vererbung (Transfer von Plastiden-Genen über Pollen) in den Nachkommen anzeigt, als auch ein Markergen (z.B. Herbizidresistenz), das einen potenziellen Transfer von Plastiden-DNA in das Kern-Genom der Pflanzenzelle nachweist und erst nach Transfer in den Zellkern exprimiert wird. Zusätzlich erleichtert ein visueller Marker (Fluoreszenz) die Identifikation von potenziellen Transformanten währen der Selektion.
  • Die von der Arbeitsgruppe Koop hergestellten transplastomischen Raps- und Maislinien werden den Arbeitsgruppen Leister und Broer für Gewächshaus- und Freilandversuche zur Verfügung gestellt.

Ergebnisse

Prüfung geeigneter Gewebeteile

Für die Erzeugung von transplastomischen Linien sind geeignete Regenerationsbedingungen für Gewebeteile aus Raps und Mais erforderlich. Diese Regenerationsbedingungen konnten für Raps sowohl aus Hypokotylen als auch aus Protoplasten etabliert werden. Eine Bewurzelung der aus Hypokotylen stammenden Regenerate wurde bereits erfolgreich durchgeführt. Die von der Arbeitsgruppe Gierl erarbeiteten Methoden zur Regeneration somatischer Embryonen des Maises wurden in die Arbeitsgruppe Koop übertragen. Es konnten anschließend erfolgreich Maispflanzen aus unreifen Embryonen regeneriert werden.

Herstellung spezieller Transformationskassetten (Transformationsvektoren)

Alle für den Transformationsvektor benötigten Elemente (Antibiotikaresistenz- und Herbizidresistenz-Gen sowie Fluoreszenzmarker) und die entsprechenden Promotoren wurden so angepasst, dass sie in den Transformationsvektor eingebracht werden können.

Die Erzeugung von transplastomischen Linien bei Mais und Raps

Im Projektverlauf wurde die Strategie zur Erstellung der Transformationsvektoren geändert. Es waren Vektoren vorgesehen, die sowohl das Ausmaß der väterlichen Vererbung der Plastidengene als auch die Häufigkeit des Genflusses von den Plastiden in den Zellkern zeigen sollten.

Nun sollen für beide Vererbungswege getrennte Vektoren eingesetzt werden. Der Vorteil der neuen Vektoren besteht darin, dass zur Analyse der Nachkommenschaft die Herbizidresistenz verwendet werden kann. Die Herbizidresistenz kann mit Linien, die auf Erde wachsen, untersucht werden, während eine Antibiotikaresistenz Sterilkulturen in vitro benötigt. Damit sollen die mit den neuen Vektoren erzeugten transplastomischen Linien wesentlich einfacher zu untersuchen sein.

Von den jeweils zwei Vektoren, die pro Kulturart benötigt werden (1. paternale Vererbung, 2. Genfluss von der Plastide in den Zellkern), ist Vektor 1 für den Raps fertig gestellt. Vektor 2 wird in Kürze verfügbar sein.