23.08.2006

Forschung Projekte

Untersuchung Pflanzen-assoziierter mikrobieller Lebensgemeinschaften

(2001 – 2005) Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie, Abteilung Angewandte Mikrobiologie und Biosafety, Schmallenberg

Thema

Derzeit wird davon ausgegangen, dass erst weniger als ein Prozent der bakteriellen Diversität im Boden erfasst ist. Die verstärkte methodische Entwicklung von Techniken zur Beschreibung der mikrobiellen Diversität ist daher eine essentielle Vorrausetzung für die Erfassung möglicher Veränderungen in der Bodenlebensgemeinschaft - beispielsweise verursacht durch den Anbau gentechnisch veränderter Kulturpflanzen.

Ziel des Forschungsvorhabens war die Entwicklung eines standardisierten Verfahrens zum begleitenden Monitoring der mikrobiellen Rhizosphärengemeinschaften (Bakterien und Pilze) transgener Kulturpflanzen.

Die Charakterisierung der Bodenmikroorganismen sollte über das Auffinden spezifischer DNA-Abschnitte auf Basis der Sondentechnik (Fingerprinting; Microarrays) weiterentwickelt werden.

Zusammenfassung

Im vorliegenden Forschungsprojekt wurde ein molekularbiologisches Verfahren zur Beschreibung der Auswirkung gentechnisch veränderter Pflanzen auf die mikrobielle Rhizosphärengemeinschaft entwickelt. Dabei kamen folgende Methoden zum Einsatz: Dot-Blot-Hybridisierungen, die Erstellung von bakteriellen und pilzlichen Klonbibliotheken, DNA-Microarrays. Zusätzlich wurde ein statistisches Auswertungsprogramm entwickelt. Die anfangs benutzte Dot-Blot-Methode stellte sich als wenig reproduzierbar heraus. Der Schwerpunkt wurde auf die Anwendung der DNA-Microarray-Technologie gelegt, die aufgrund ihrer methodischen Auslegung besser für die Untersuchung größerer Probenmengen geeignet ist. Unter Verwendung dieser Technik konnten für acht bis zehn von insgesamt 97 untersuchten Sonden signifikante Expressionsunterschiede für den Einflussfaktor transgen – nicht transgen gezeigt werden.

Versuchsbeschreibung

Zur Charakterisierung mikrobieller Lebensgemeinschaften wurden molekularbiologische Techniken eingesetzt, bei denen nicht der lebende Organismus isoliert und kultiviert werden muss, sondern ausschließlich mit Markermolekülen gearbeitet wird. Mit Hilfe dieser Markermoleküle wurden die in der untersuchten Umweltprobe vorkommenden Bakterien und Pilze identifiziert. Dazu wurde die aus dem Boden isolierte DNA mit bekannten DNA-Sequenzen verglichen.

Da bei diesem Projekt eine große Anzahl von Proben bearbeitet wurde und eine eindeutige Charakterisierung der Mikroorganismen erfolgen sollte, wurden unterschiedliche Hybridisierungstechniken eingesetzt. Bei diesen Techniken binden Nukleinsäuren, die aus den zu untersuchenden Proben extrahiert werden, an spezifische kurze DNA-Fragmente (Oligonukleotide). Ein gekoppelter Farbstoff macht diese Bindung sichtbar. Das eingesetzte Oligonukleotid ermöglicht Rückschlüsse auf die vorkommenden Mikroorganismen.

Vorrangig sollten Hybridisierungen über die Microarray-Technik optimiert werden. Hierbei werden bekannte DNA-Sequenzen, die als Sonden dienen, punktförmig auf Glasobjektträger aufgetragen. Anschließend wird die aus dem Bodenmaterial extrahierte DNA dazugegeben. Diese kann dann im Falle von Hybridisierungen mit der Sonden-DNA näher identifiziert werden. Die Mikroarray-Technik ermöglicht die Bearbeitung großer Probenmengen. Außerdem ist heute eine Vielzahl an Sonden verfügbar. Sie reichen von den heute bekannten Mikroorganismen-Gruppen bis zu pilzlichen und bakteriellen Pflanzen-Pathogenen.

Ergebnisse

DNA-und RNA-Extraktion

In den ersten drei Projektjahren wurden Proben aus Boden und Wurzelraum von konventionellen Raps- und Maispflanzen sowie transgenen Maispflanzen genommen. Für die DNA- und RNA-Extraktion aus diesen Proben wurden Laborprotokolle erarbeitet.

Zuordnung der Gen-Sequenzen

Dot-Blot-Hybridisierung. Mittels Dot-Blot-Hybridisierung wurden die extrahierten Nukleinsäuren gegen ausgewählte Oligonukleotide hybridisiert. Auf diese Weise konnten die Bakteriengruppen definiert und quantifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass die Dot-Blot-Hybridisierung aufgrund mangelnder Reproduzierbarkeit und großem Arbeitsaufwand für die routinemäßige Aufarbeitung großer Probenmengen nicht geeignet ist. Aus diesen Gründen wurde entschieden, die weiteren Untersuchungen auf Basis der Microarray-Technik durchzuführen.

Microarray. Hierzu wurden Microarrays mit Bakterien-spezifischen Sonden hergestellt und ein Hybridisierungsprotokoll erarbeitet. Bei dem Vergleich der manuellen Hybridisierung versus einer automatischen Hybridisierung zeigte sich, dass die erzielte Signalintensität bei der automatischen Variante deutlich geringer war. Deshalb wird in Zukunft mit der manuellen Variante weitergearbeitet.

Klonbibliotheken

Des weiteren wurden Klonbibliotheken für Bakterien und Pilze angelegt. Die Analyse der bakteriellen Klonbibliotheken ergab eine große Vielfalt an unterschiedlichen Sequenzen. Die gefundenen Bakteriengruppen bei Mais und Raps waren sich sehr ähnlich. Die am häufigsten gefunden Bakteriengruppen waren a- und b-Proteobacteria. Dies korreliert mit den hohen Werten für a-Proteobacteria bei der Dot-Blot-Hybridisierung. Ca. 25 Prozent der Bakteriensequenzen konnten nicht phylogenetisch eingeordnet werden (heute noch unbekannte Bakterien).

Bei der Untersuchung der pilzlichen Sequenzen zeigte sich, dass der Großteil der Rhizosphäre-Pilze heute noch unbekannt ist (bei ca. 75 Prozent keine phylogenetische Zuordnung möglich). Asco-, Basidio- und Chytridiomycota wurden in nahezu gleichen Teilen gefunden.

Statistische Auswertung

Ein großer Teil der mittels Microarray-Technik gewonnenen Genexpressionsdaten wurden statistisch ausgewertet. Es zeigte sich, dass bei acht bis zehn der insgesamt 97 untersuchten DNAs relevante Unterschiede der zugehörigen Genexpressionswerte zu erkennen waren.

Insbesondere ist bei diesen DNAs ein Unterschied in Bezug auf die Rhizospährenzusammensetzung zwischen transgenen und nicht-transgenen Wurzelproben zu erkennen, der im Hinblick auf das gewünschte Monitoring von Anbaufeldern durchaus von Interesse ist.