Erzeugung Markergen-freier Pflanzen durch Nutzung eines Rekombinationssystems (Cre/lox)

(2001 – 2004) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) (seit 2008 Julius Kühn-Institut (JKI)), Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Braunschweig

Thema

Es sollte eine neuartige Methode zur Herstellung Markergen-freier transgener Kulturpflanzen entwickelt werden.

Das eingeführte Markergen sollte unter Nutzung eines bakteriellen Rekombinationssystems (cre/lox-System) aus der transgenen Pflanze entfernt werden.

Zunächst wurde das System an transgenen Tabakpflanzen etabliert. Später sollte es auf die Kartoffel (vegetativ vermehrt) übertragen werden. Ziel ist eine markerfreie Kartoffel mit reduziertem Amylosegehalt.

Zusammenfassung

Es wurde eine neue Methode zur Markergen-Eliminierung über transiente Expression von Rekombinase (cre) etabliert:

  • Die Rekombinase, die das Markergen „herausschneidet“, ist in transgenen Pflanzenzellen aktiv. Die Übertragung der Rekombinase funktioniert sowohl über einen pflanzlichen Virus (PVX, TMV) als auch mit Agrobacterium tumefaciens.
  • Für die Entwicklung der rekombinierten Pflanzenzellen zu ganzen Pflanzen konnten zwei Strategien angewendet werden: Regeneration und Selbstbestäubung.
  • Übertragung der transgenen Eigenschaft auf die nächste Generation: Nachkommen aus Selbstbestäubung waren markerfrei. Ein PVX-Cre-Vektor wurde an Kartoffel angewendet. Die ersten Experimente zeigten Erfolg versprechende Ergebnisse

Versuchsbeschreibung

Um das Markergen zu eliminieren, wurde mit einem cre/lox-Rekombinationssystem gearbeitet.

Zuerst wurde ein Markergen (bar), das eine Herbizidresistenz vermittelt, zwischen den Erkennungssequenzen (= lox-Sites) in Tabak transformiert. Durch das Markergen wird die Expression des ebenfalls eingefügten Reportergens (gfp) verhindert.

Die Einführung der Rekombinase (cre) führt zum Herausschneiden des Markergens und zur gfp-Fluoreszenz. Das Gen für die zum Herausschneiden erforderliche Rekombinase wurde auf verschiedene Arten zeitweise (transient) in die Pflanzen gebracht:

  • Zum einen über zwei verschiedene virale Klone. Die verwendeten Viren sind nicht samenübertragbar. Daher sind die Nachkommen dieser Pflanzen virusfrei und besitzen auch das Rekombinase-Gen nicht mehr.
  • Zum anderen über Agrobakterien (Agroinfiltration). Dieser Weg ist vor allem für vegetativ vermehrte Pflanzen interessant, da die Viren nur über Samen entfernt werden können.

Die Eliminierung der Markergene wird über PCR und Southern-Analyse getestet.

Die durch die Rekombinase cre ausgelösten Rekombinationsereignisse können auf die nächste Generation über Regeneration oder Selbstbestäubungsstrategien übertragen werden.

  • Regeneration: Infizierte Blätter und mittels Agrobakterien transformierte Zellen wurden zur Regeneration verwendet. Markerfreie regenerierte Pflanzen wurden für die Segregationsanalyse der Nachkommen selbstbestäubt.
  • Selbstbestäubung: Zusätzlich wurden infizierte Pflanzen selbstbestäubt. Da die verwendeten Viren nicht samenübertragbar sind, sind die Nachkommen dieser Pflanzen - wie auch die der Regenerate aus infizierten Blättern - virusfrei.

Die Segregationsanalyse der Nachkommen erfolgte über Keimtests. Die Keimlinge wurden auf Herbizidresistenz und gfp-Fluoreszenz getestet.

Ergebnisse

Es wurden ein A.tumefaciens-Vektor sowie virale Vektoren (PVX und TMV) hergestellt, die das zum Herausschneiden des Markers erforderliche Rekombinasegen (cre) stabil tragen. Das Rekombinasegen konnte transient in Pflanzen abgelesen werden - d.h. das Gen war nur vorübergehend aktiv und wurde nicht in das Pflanzen-Genom integriert.

Von 45 möglichen Transformanten wurden drei unabhängige Linien nach Southern-Analyse für die Markergen-Eliminierung eingesetzt. Alle drei Vektoren bewirkten erfolgreich das Ausschneiden des Markergens aus der gesamten Pflanze.

Regeneration: Mit beiden Virenvektoren (PVX und TMV) waren zwischen 47 und 61 Prozent der regenerierten Pflanzen markerfrei. Das Ausschneiden des bar-Gens wurde auf die nächste Generation übertragen. Die meisten untersuchten Keimlinge waren gfp-positiv.

Mit dem A. tumefaciens-Vektor waren 34 Prozent der regenerierten Pflanzen markerfrei. Kein getesteter Samen zeigte Herbizidresistenz. 109 von 114 getesteten Samen waren gfp-positiv. Daher kann mit dem A. tumefaciens-Vektor Markergen-Eliminierung mittels Regeneration erreicht werden.

Selbstbestäubung: Nachkommen von sechs der acht durch Selbstbestäubung erzeugten PVX-Cre-Pflanzen zeigten eine erfolgte Rekombination. Dagegen wurden mit dem TMV-Cre-Vektor nur wenige markerfreie Pflanzen gefunden, von denen keine gfp-Aktivität aufwies. D.h., dass die Methode für den PVX-Cre-Vektor sehr effektiv, aber nicht für den TMV-Cre-Vektor anwendbar ist.

Praktische Anwendung: Der Erfolg in der Modellpflanze Tabak lässt eine praktische Anwendung möglich erscheinen.

Als ersten Schritt zur Herstellung amylosearmer, markerfreier Kartoffelpflanzen wurde ein Vektor mit einem gbss-Gen und einem von lox-Sites umgebenen nptII-Gen erstellt. Über Agrobakterien-Transformation wurden über hundert transgene Kartoffellinien erhalten und auf Amylose-Gehalt getestet. Drei Linien mit reduziertem Amylosegehalt wurden für weitere Versuche ausgewählt.

Es konnte gezeigt werden, dass die Rekombinase (mit PVX-Cre-Virus) in infizierten Kartoffelblättern funktioniert. Regenerierte Pflanzen aus infizierten Blättern werden zurzeit molekular analysiert.