05.08.2005

Forschung Projekte

Erzeugung Markergen-freier Pflanzen durch Nutzung eines Rekombinationssystems

(2001 – 2004) Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft, Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung; Freising , Kartoffel

Thema

In diesem Projekt wurde eine neuartige Methode zur Herstellung Markergen-freier transgener Kulturpflanzen untersucht.

Um die Markergene zu entfernen, wurde hier ein bestimmtes sequenzspezifisches Rekombinationssystem - das γδ Resolvase/res-System - verwendet. Nach Prüfung des Systems sollte es bei Kartoffeln mit veränderter Stärkezusammensetzung angewandt werden.

Zusammenfassung

Das Testsystem wurde in Kartoffel- Protoplasten überprüft.

Die Funktionalität des γδ Resolvase/res-Systems wurde nachgewiesen. Es funktioiniert sowohl dann, wenn die zu entfernenden DNA- Abschnitte auf Plasmiden liegen, als auch dann, wenn die DNA- Abschnitte ins Genom integriert sind.

Außerdem konnte das System für die spezifischen Bedingungen bei Kartoffelpflanzen optimiert werden.

Versuchsbeschreibung

Vor Beginn der Experimente gab es keine Erfahrungen damit, ob sich das aus Bakterien stammende Rekombinationssystem γδ Resolvase/res auch für die Anwendung bei Pflanzen eignet. Um es herauszufinden, wurde das System zunächst an pflanzlichen Protoplasten getestet. Auf diese Weise lässt sich das System schneller optimieren, da die langwierige Herstellung transgener Pflanzen umgangen wird.

• Das γδ Resolvase-Gen wird auf Kartoffel-Protoplasten übertragen. Zugleich werden DNA-Sequenzen eingeführt, die einen Promotor und ein Reporter-Gen tragen. Die Aktivität des Reporter-Gens wird durch den Einbau von zusätzlichen DNA-Abschnitten, die von speziellen Erkennungsbereichen, den „res-Sites“ flankiert sind, unterdrückt. Die γδ Resolvase erkennt diese „res-Sites“ und entfernt die dazwischen liegenden DNA-Abschnitte. Nur wenn diese Abschnitte ausgeschnitten werden, schaltet der Promotor das Reporter-Gen ein: Es bildet sich ein sichtbarer blauer Farbstoff.
• In einem zweiten Schritt werden mittels Agrobakterien-vermittelter Transformation transgene Kartoffeln hergestellt. Diese enthalten von zwei res-Sites flankierte Markergene und das Gen für die veränderte Stärkezusammensetzung (anti-sense GBBS). Sie ermöglichen sowohl die Kontrolle über den erfolgreichen Einbau der Gene in die Pflanzen als auch über die Entfernung der Markergene.

Um zu überprüfen, ob die Markergen-freien Pflanzen die erwünschte veränderte Stärkezusammensetzung aufweisen, werden Knollen im Stärketest untersucht. Zur Kontrolle werden transgene Kartoffeln herangezogen, in die das GBSS-Zielgen mit konventionellen Verfahren übertragen wurde.

Es wurden verschiedene Kartoffelsorten transformiert. Die ersten Schritte wurden mit verschiedenen molekularbiologischen Verfahren überprüft. Später wurden die markerfreien Pflanzen im Gewächshaus auf Stabilität und Stärkezusammensetzung untersucht.

Ergebnisse

• Das γδ Resolvase-Gen wurde erstellt (Gensynthese) und in PCR-Untersuchungen überprüft.
• Dabei wurden durch geeignete Erkennungssequenzen (Primer) Mutationeneingeführt, die zu einer optimierten Expression und Rekombinaseaktivität in Kartoffelpflanzen führen können.
• Die γδ Resolvase-Gensequenzen wurden in Expressions-Konstrukte eingefügt, die eine Produktion des entsprechenden γδ Resolvase-Proteins in Kartoffelpflanzen zulassen. Des Weiteren wurden DNA-Substrate erzeugt, die res-Sites tragen und bei erfolgter Rekombination zur Aktivität eines Reporter-Gens führen. Das Testsystem wurde in Kartoffel-Protoplasten überprüft. Die Funktionalität des Systems wurde bewiesen und zwar sowohl dann, wenn die zu entfernenden DNA Abschnitte auf Plasmiden liegen, als auch dann, wenn die DNA Abschnitte ins Genom integriert sind.
• γδ Resolvase mit der ursprünglichen Aminosäureabfolgekann sogar stark verkürzte res-Sites erkennen. Davon ausgehend wurden minimierte T-DNA Konstrukte erstellt, die eine res-flankierte Markergen-Kassette tragen und zur Ausprägung der veränderten Stärkezusammensetzung vor allem in der Kartoffelknolle führen sollen. In Transformationsexperimenten wurden die neuartigen T-DNA Sequenzen in Kartoffelpflanzen übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion der ursprünglich 114 Basenpaare langen res-Sequenz möglich ist und die Funktionalität dabei erhalten bleibt. Außerdem konnte durch eine Optimierung der DNA-Sequenz der Resolvase auf die spezifischen Bedingungen bei Kartoffelpflanzen eine verbesserte Wirksamkeit erreicht werden.