14.09.2005

Forschung Projekte

Entwicklung neuer Methoden zur gezielten Veränderung von Genen in der Pflanze

(2001 – 2004) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) (seit 2008 Julius Kühn-Institut (JKI)), Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit; Braunschweig

Thema

Es sollten verschiedene Methoden entwickelt und getestet werden, mit deren Hilfe bereits vorhandene Gene der Pflanze gezielt verändert werden können (= in situ-Modifikation und/oder Inaktivierung). Dazu wurden Oligonukleotide (kurze DNA/RNA-Fragmente) eingesetzt, die sich an das fragliche Gen anlagern und eine gezielte Veränderung ermöglichen sollten.

Information zum Verfahren:

Zusammenfassung

Es wurde ein in-vitro-Testsystem zur Optimierung der Oligonukleotide etabliert. Im Labor konnte gezeigt werden, dass die Oligonukleotide sequenzspezifisch an das Zielgen binden.

Blattzellen aus den transgenen Modell-Pflanzen wurden isoliert und mit den modifizierenden Oligonukleotiden transformiert. Die daraus entstandenen Kalli (undifferenzierte Zellhaufen) wurden auf die erfolgreiche Aktivierung der Modellgene (gfp-Gen: Fluoreszens; pat-Gen: Selektion auf Phosphinotricin) untersucht.

Aufgrund der spezifischen Bedingungen der pflanzlichen Zelle konnte das bei Tieren funktionierende System nicht auf die Pflanze übertragen werden.

Versuchsbeschreibung

GFP-Fluoreszenz in Ackerschmalwand (Arabidopsis) (oben) und Kartoffeln (unten).

Dargestellt sind jeweils die Linien mit den Kontrollkonstrukten, in denen das fluoreszierende GFP-Protein sofort exprimiert wird.

Es wurden verschiedene Versuchsschritte durchgeführt.

  • Erstellung von Testkonstrukten mit einem inaktiven Reporter-Gen (gfp bzw. pat). Diese Gene sollen erst durch die sequenzspezifische Veränderung aktiviert werden. In Kontrollkonstrukten wird das Reportergen sofort exprimiert.
  • Transformationen von Kartoffel und Ackerschmalwand (Arabidopsis) mit den verschiedenen Konstrukten.
  • Design und Optimierung verschiedener Oligonukleotide, die eine direkte Veränderung von Genen ermöglichen sollen.
  • Im Labor wurde zunächst getestet, ob die Oligonukleotide an die Gene binden (und dabei sogenannte Triple-Helices ausbilden). Der Nachweis erfolgt elektrophoretisch, da sich Triple Helices im Gel langsamer als die „normale“ DNA-Doppelhelix bewegen. Mittels eines Fluoreszenzfarbstoffs kann der Transfer der Oligonukleotide in Zellen im Mikroskop verfolgt werden.

Ergebnisse

Kartoffel-Protoplast nach Elektroporation: Im Zellkern sind die eingeführten Oligonukleotide durch den Rhodamin-Farbstoff zu erkennen. (Aufnahme ca. 30 min nach der Transformation)

Es wurden Modellgene (gfp und bar) kloniert und in Ackerschmalwand- und Kartoffelpflanzen transformiert. Die neuen Konstrukte wurden zunächst transient (keine stabile, sondern eine vorübergehende Transformation) in Kartoffel- Protoplasten getestet.

  • Für die Optimierung des Designs der Oligonukleotide wurde ein in-vitro-Testsystem etabliert. Mit Hilfe dieses Systems können die Oligonukleotide vor dem Einsatz in lebende Zellen optimiert werden.
  • Es wurden verschiedene Oligonukleotide konstruiert. Die sequenzspezifische Bindung an das Zielgen konnte in Laborversuchen nachgewiesen werden.
  • Die effiziente Aufnahme von Oligonukleotiden in Kartoffel-Protoplasten und ihr rascher Transport in den Zellkern wurden mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes gezeigt (siehe Foto).

Leider konnte in den Protoplasten (40,5 Mio. untersuchte Protoplasten!) bzw. den regenerierten Kalli (ca. 100 000 Stück) keine erfolgreiche Modifizierung des Modellgens nachgewiesen werden. Das Rekombinationssystem des pflanzlichen Zellkerns scheint der entscheidende Engpass bei der Übertragung dieser Gen-Modifizierungsstrategie vom tierischen auf das pflanzliche System zu sein.