Biomonitoring – Neue Methoden zum Nachweis transgener DNA in Boden- und Pflanzenproben

(2001 – 2004) Universität Oldenburg, Fachbereich Biologie, Arbeitsgruppe Genetik

Thema

Die bislang vorhandenen Verfahren zum Nachweis von Erbmaterial (DNA) erlauben zwar einen empfindlichen Nachweis transgener DNA beispielsweise in Nahrungsmitteln und Pflanzen, sind jedoch für einen routinemäßigen Einsatz etwa im Rahmen von Monitoring-Aufgaben mit großen Probenumfängen nur bedingt geeignet.

Zum DNA-Nachweis wird häufig die Polymerase-Kettenreaktion (PCR-Verfahren) eingesetzt. Einige methodische Probleme erschweren jedoch den routinemäßigen Einsatz beispielsweise bei Bodenuntersuchungen. So sind z.B. für die Durchführung hochgereinigte Extrakte erforderlich. Weiterhin kann die Sensitivität des PCR-Verfahrens bei geringfügiger Änderung einzelner Parameter in weiten Grenzen variieren. Daher sind Nachweisverfahren erwünscht, die sowohl sensitiv als auch einfach in der Anwendung sind und reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Aus diesem Grund sollte ein von der PCR unabhängiges Verfahren zum Nachweis von Transgen-Sequenzen gentechnisch veränderter Pflanzen entwickelt werden. Das Prinzip des Nachweises beruht auf der Identifizierung des Transgens durch natürliche Transformation lebender Bakterien.

Ein speziell konstruiertes Bakterium der Art Acinetobacter.sp. dient dabei quasi als lebender Indikator für das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein eines Transgens in der zu untersuchenden Pflanzen- oder Bodenprobe.

Dieses Verfahren wird daher auch als Biomonitoring-Verfahren bezeichnet.

Zusammenfassung

Es sollte ein einfaches und dennoch empfindliches Verfahren zum Nachweis transgener DNA in Pflanzen- und Bodenproben entwickelt werden. Bei dem hier durchgeführten Biomonitoring-Verfahren wurden für das nachzuweisende Transgen spezielle Empfängerbakterien der Spezies Acinetobacter sp. konstruiert. Die Bakterien können nur dann überleben, wenn sie das Transgen aufnehmen und in ihr Genom integrieren.

Nach diesem Prinzip wurden zum Nachweis von Transgenen mit Antibiotikaresistenz-Gen Bakterienzellen eingesetzt, die ein unvollständiges Antibiotikaresistenz-Gen trugen und die Transgen-DNA zur Reparatur benötigten. Der Nachweis von Transgenen ohne Antibiotikaresistenz-Gen war ebenfalls möglich und erfolgte durch ein eingeführtes „Selbstmord-Gen“ in den Empfängerzellen.

Die hohe Sensitivität des Biomonitorings beim Nachweis geringer DNA-Spuren konnte bestätigt werden. Von Vorteil ist, dass diese Verfahren im Gegensatz zur PCR keine hochgereinigte DNA erfordern.

Die Biomonitoring-Systeme wurden auf über 500 Proben transgener Pflanzen aus Freisetzungsversuchen angewandt. Dabei wurde eine Entlassung rekombinanter DNA aus Pollen und Wurzeln lebender transgener Pflanzen beobachtet.

Versuchsbeschreibung

Der DNA-Nachweis in Pflanzenproben erfolgt üblicherweise mit Hilfe des PCR-Verfahrens. DNA-Spuren werden bei dieser Methode soweit vervielfältigt (in vitro-Amplifikation), dass sie z.B. mittels geeigneter Fluoreszens-Farbstoffe sichtbar gemacht werden können. Auslöser für die spezifische Vervielfältigung ganz bestimmter Gensequenzen sind spezielle Startsequenzen (Primer), die sich nur mit der gesuchten DNA verbinden.

In Analogie zur PCR erfolgt beim Biomonitoring-Verfahren der Nachweis der gesuchten Transgene über deren Vermehrung, hier jedoch in Indikator-Bakterien (in vivo-Amplifikation). Es werden speziell für das nachzuweisende Transgen entsprechende Empfängerbakterien konstruiert. Diese tauschen dann – falls in der Probe das gesuchte Transgen vorliegt - die eigene (markierte) Transgenkopie gegen das aus der Pflanze stammende Transgen aus (siehe Abbildung).

Prinzip des Biomonitorings

Die Empfänger-Bakterien sind so konstruiert, dass nur diejenigen Bakterienzellen überleben, die erfolgreich transformiert werden, d.h. den Austausch der eigenen (markierten) Transgenkopie gegen das aus der Pflanze stammende Transgen durchführen können. Liegt in der zu untersuchenden Probe das Transgen nicht vor, kann der Austausch nicht stattfinden. Die Bakterienzellen werden dann während der folgenden Selektion abgetötet. Das Wachstum unter Selektionsbedingungen stellt somit den Nachweis für die Anwesenheit des Transgens in der Probe dar.

Ergebnisse

Nachweis von Antibiotikaresistenz-Genen

Mehrere Biomonitoring-Systeme wurden erfolgreich entwickelt. Es wurden Bakterienzellen konstruiert, die jeweils ein unvollständiges Antibiotikaresistenz-Gen trugen. Durch Aufnahme des entsprechenden Transgens wird dieses vervollständigt und die Bakterien sind in der Lage, in Anwesenheit des entsprechenden Antibiotikums zu wachsen. Können sich die Bakterien im Antibiotikum-haltigen Medium vermehren, dann zeigt das die Anwesenheit des Transgens in einer untersuchten Probe an. Bisher konnten auf diese Weise Transgensequenzen mit dem Kanamycinresistenz-Gen nptII (im Kern-Genom) bzw. dem Spectinomycinresistenz-Gen aadA (im Plastiden-Genom) sehr sensitiv nachgewiesen werden.

Nachweis von Transgenen ohne Antibiotikaresistenz-Gen

Auch für Transgene ohne Antibiotikaresistenz-Gen wurden effektive Biomonitoring-Systeme entwickelt. Dazu wurden die Bakterienzellen mit einem einschaltbaren „Selbstmord-Gen“ ausgestattet. Ohne Anwesenheit des gesuchten Transgens sterben die Bakterienzellen ab. Falls das gesuchte Transgen jedoch vorhanden ist, wird es so in das Bakterien-Genom integriert, dass es das „Selbstmord-Gen“ ersetzt. Überlebende Zellen stellen somit den Nachweis für die Anwesenheit des Transgens in einer untersuchten Probe dar.

Nachweis der Entlassung rekombinanter DNA durch Biomonitoring

Durch Biomonitoring wurde die Entlassung rekombinanter DNA aus Pollen und Wurzeln lebender transgener Kartoffelpflanzen nachgewiesen

Es konnte bestätigt werden, dass die Biomonitoring-Verfahren ähnliche Sensitivität im Nachweis geringer DNA-Spuren aufweisen wie die PCR. Von Vorteil ist, dass diese Verfahren im Gegensatz zur PCR keine hochgereinigte DNA erfordern.

Die Biomonitoring-Systeme wurden auf über 500 Proben von Freisetzungsversuchen transgener Pflanzen angewandt. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, das transgene Pflanzen bereits während des normalen Wachstums (und nicht erst während ihrer Zersetzung) rekombinante DNA entlassen. Dies geschieht sowohl über die Wurzeln als auch über Pollen.