26.02.2003

Forschung Projekte

Untersuchung möglicher Auswirkungen transgener, virusresistenter Pflanzen am Beispiel des Scharkavirus der Pflaume (PPV)

(1989 – 1992) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) (seit 2008 Julius Kühn-Institut (JKI)), Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Braunschweig

Thema

Mit dem Ziel virusresistente Pflanzen zu züchten, werden mittels gentechnischer Methoden Gensequenzen von Viren in das pflanzliche Genom übertragen. Ein Erfolg versprechender Ansatz ist das Einbringen speziell solcher Genomabschnitte, die für das Hüll-Protein des Virus codieren. Auf diese Weise wird von der Pflanze eine Immunreaktion ausgelöst, die vor Virenbefall schützt.

Eine wichtige Zielsetzung des Projektes ist es, am Beispiel der Übertragung von Teilen des Genoms des Pflaumen-Scharkavirus (PPV, plum pox virus) möglichen nachteiligen Folgen dieses gentechnischen Ansatzes wie der Bildung neuer Viren nachzugehen.

Zusammenfassung

Charakterisierung. Es konnte ein Überblick über die genomische Verschiedenartigkeit von Scharkavirus-Populationen durch den Einbezug von vier verschiedenen PPV-Isolaten aus unterschiedlichen geographischen Regionen gewonnen werden.

Überprüfung der Resistenzstrategie. Es wurde nachgewiesen, dass die gentechnische Resistenzstrategie auf Basis der Übertragung viraler Gene, die für Hüllproteine codieren, auch im Fall des Scharkavirus wirkt.

Transkapsidierungen und Virus-Rekombinationen. Weiterhin konnten Testverfahren zur Überprüfung von Transkapsidierungen (heterologe Enkaspidierung) und Virus-Rekombinationen entwickelt werden.

Eine Transkapsidierung war in ersten Versuchen nicht nachzuweisen.

Die Testmodelle sowohl zur Überprüfung von natürlichen Rekombinationen nach Virus-Mischinfektionen in nicht-transgenen Pflanzen als auch von Rekombinationen nach Infektion der transgenen virusresistenten Pflanzen mit Hüllprotein-Virusklonen sind noch weiterzuentwickeln.

Versuchsbeschreibung

Molekularbiologische Charakterisierung des Scharkavirus

Zur gentechnischen Nutzung des Hüllproteingens sollte für unterschiedliche Virus-Isolate die genomische Sequenz – die Viruspartikel enthalten jeweils einen einzelsträngigen RNA-Strang – entschlüsselt werden.

Herstellung transgener Pflanzen – Nachweis der Hüllprotein-Expression – Überprüfung der Virus-Resistenz

Das Hüllprotein-Gen unterschiedlicher Scharka-Virus-Isolate wurde in die Modellpflanze Tabak eingebracht und die Expression der Transgene überprüft. Anschließend wurde durch Infektion der transgenen Tabakpflanzen mit Scharkaviren die Virus-Resistenz überprüft.

Transkapsidierung

Transgene Pflanzen wurden mit unterschiedlichen Viren infiziert. Aus dem Blattmaterial gewonnene Virus-Isolate wurden anschließend mittels immunologischer Tests auf transgenes Hüllprotein geprüft.

Virus-Rekombinationen

nach Mischinfektion in nicht-transgenen Pflanzen. Um Rekombinationen zwischen Viren zu prüfen, wurden Pflanzen mit unterschiedlichen Anteilen verschiedener PPV-Isolate mischinfiziert. Anschließend sollten mittels PCR die Genome der aus dem Blattmaterial gewonnenen Virus-Isolate auf Rekombinationen untersucht werden.

nach Infektion transgener Pflanzen mit infektiösen künstlichen Hüllprotein-Virusklonen. Zur Untersuchung eines möglichen Austauschs von Erbinformation zwischen transgener Pflanze und infizierenden Viren wurde ein Testmodell entwickelt. Es wurde ein Virus-Klon konstruiert, der die gesamte Erbinformation des Hüllproteins beinhaltet. Anschließend wurden transgene Wirtspflanzen mit diesen Klonen infiziert.

Ergebnisse

Molekularbiologische Charakterisierung des Scharkavirus

Es ist gelungen, das komplette Genom verschiedener PPV-Isolate zu ermitteln. Die Hüllprotein-Region wurde identifiziert.

Hüllprotein-Expression und Überprüfung der Virus-Resistenz

Tabak-Pflanzen wurden erfolgreich und stabil mit dem Hüllprotein-Gen transformiert. Die Expression war nachzuweisen. Eine Erhöhung der Resistenz in den transgenen Pflanzen konnte gezeigt werden.

Transkapsidierung

Im Rahmen erster Untersuchungen war nach Infektion transgener Pflanzen mit Scharkaviren keine Transkapsidierung nachzuweisen.

Virus-Rekombinationen

nach Mischinfektion in nicht-transgenen Pflanzen. Es konnte ein Testverfahren zur Überprüfung natürlicher Rekombinationen zwischen Viren nach Mischinfektion entwickelt werden. Weitere Optimierungen sind aber nötig.

nach Infektion transgener Pflanzen mit infektiösen künstlichen Hüllprotein-Virusklonen. Um einen möglichen Austausch von Erbinformationen zwischen transgener virusresistenter Pflanze und dem Genom infizierender Viren nachzuweisen, wurde ein empfindliches Testverfahren entwickelt. Es ergaben sich erste Hinweise von derartigen Rekombinationen.