Eliminierung überflüssiger Fremd-DNA aus transgenen Pflanzen (Rekombinationssystem Cre/lox)

(1993 – 1996) Biologische Bundesanstalt (BBA) (seit 2008 Julius Kühn-Institut (JKI)), Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit; Braunschweig

Thema

Es wurden verschiedene Strategien zur Entfernung von Markergenenaus transgenen Kulturpflanzen getestet, die auf der Verwendung des Rekombinationssystems (Cre/lox) beruhen.

Dabei soll die Rekombinase (Enzym, welches das Markergen aus dem DNA-Stang herausschneidet) entweder bei Bedarf aktiviert (Induktion) oder bis zur Nutzung unterdrückt (Repression) werden.

Die Konstrukte wurden an transgenem Tabak und Ackerschmalwand (Arabidopsis) überprüft.

Informationen und Schaubilder zu Rekombinationssystemen:

Zusammenfassung

Es konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Komponenten des Systems (Promotor, Regulatoren, Rekombinase) alleine und in Kombination prinzipiell funktionieren.Die Induktion der Rekombinase erwies sich als geeigneter als deren Repression.

Für eine praktische Anwendung sind aber noch Verbesserungen notwendig.

Versuchsbeschreibung

Je nach Strategie (Induktion oder Repression) wurde das Rekombinase-Gen von zwei verschiedenen Promotoren reguliert. Durch Zugabe bzw. Fehlen des Antibiotikums Tetrazyklin wurde das Rekombinase-Gen angeschaltet und somit Rekombinase gebildet.

Das Rekombinase-Gen lag jeweils gemeinsam mit einem Reporter-Gen zwischen den Erkennungssequenzen (= lox-sites). Das Funktionieren der Konstrukte konnte anhand der Expression des Reporter-Gens (gus- bzw. Luciferase-Gen) überprüft werden. Die transgenen Tabakpflanzen wurden jeweils zur Hälfte mit und ohne Tetrazyklin kultiviert. Zusätzlich wurde die gewünschte Eliminierung des Markergens mit PCR und Southern-Hybridisierung untersucht.

Zunächst wurden die Konstrukte transient in Blättern bzw. Protoplasten (Ackerschmalwand) auf ihre Funktion überprüft. Anschließend wurden die Konstrukte in transgene Tabakpflanzen transformiert, in denen bereits die Regulatoren der Promotoren vorlagen. Zuletzt wurde das gesamte System, d.h. Rekombinase-Gen, Repressor bzw. Induktor und Reporter-Gen (gus), zwischen zwei lox-sites liegend, in einem Schritt in Tabakpflanzen übertragen.

Ergebnisse

Transient – ohne feste Integration in das Pflanzengenom – waren sowohl Repression als auch Induktion gut regulierbar.

Anders bei einer stabilen Transformation: Die Repressionssysteme waren nicht geeignet, da die Repression der Rekombinase nicht ausreichte und dadurch das Markergen zu früh herausgeschnitten wurde.

Nur das Induktionssystem war erfolgversprechend, auch wenn bisher nach Induktion nur geringe Aktivitäten gemessen werden konnten. Problematisch ist allerdings die erforderliche Anwesenheit von Tetrazyklin während Transformation, Regeneration und Kultivierung der Pflanzen.