Als Phosphorylierung bezeichnet man das reversible Anhängen einer Phosphatgruppe an ein organisches Molekül, insbesondere an Proteine. Das Resultat sind Phosphoproteine.

Die Enzyme, welche die Phosphorylierung von Proteinen katalysieren, heißen Proteinkinasen.

Dabei wird eine Phosphatgruppe kovalent an einen Aminosäurerest gebunden, in der Regel mit ATP als Substrat für das Phosphat.

Eine andere Enzymkategorie, die Phosphatasen, können diesen Prozess umkehren, d.h. die Phosphatgruppe wird vom Protein entfernt. Proteinkinasen und -phosphatasen sind dabei in der Regel sehr spezifisch und können ebenfalls in ihrer Aktivität gezielt kontrolliert werden.

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