Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Als PCR (Polymerase-Chain-Reaction, Polymerase-Kettenreaktion) bezeichnet man eine künstlich herbeigeführte Vervielfältigung von bewusst ausgewählten DNA-Sequenzen. Dabei werden die vervielfältigten Sequenzen wiederum als Vorlage für weitere Vervielfältigungen verwendet, so dass man von einer Ausgangssequenz eine exponentiell ansteigende Zahl von Duplikaten erhält.

Mit Hilfe der PCR können Nachweise auf genetischer Ebene erbracht werden, etwa zur Aufklärung von Verbrechen (genetischer Fingerabdruck), zur Erkennung von Erbkrankheiten, Virusinfektionen oder zur Klärung von Verwandtschaftsverhältnissen (Vaterschaftstests, Stammbäume).

Ein Nachteil dieser Methode ist, dass keine kompletten DNA-Stränge repliziert werden können, sondern nur kurze Abschnitte (maximal bis 40 Kilobasenpaare (kbp), also 40.000 Basenpaare)

Ablauf

Zur Durchführung einer PCR sind folgende Dinge nötig:

  • die zu untersuchende DNA-Ausgangssequenz (Vorlage, engl. Template)
  • zwei künstlich erstellte (konstruierte) Primer als Andockstellen für die Polymerase
  • eine hitzebeständige DNA-Polymerase (meist die sogenannte Taq-Polymerase, ein hitzebeständiges Enzym des Bakteriums Thermus aquaticus, das in Geysiren lebt)
  • eine Lösung, die unter anderem die nötigen Basen (Desoxyribonucleosidtriphosphate) als Bausteine enthält und für eine für die Polymerase geeignete Arbeitsumgebung sorgt (Pufferlösung)
  • ein geeignetes Gerät, dass die jeweils für die einzelnen Schritte erforderlichen Temperaturen erzeugt (Thermocycler).

Der Ablauf wird in mehrere Phasen unterteilt:

  • Denaturierung (melting)
  • Primerhybridisierung (primer annealing)
  • Elongation

Das oben beschriebene Gemisch wird in ein dichtes Gefäß gefüllt und in den Cycler gestellt. Dieser enthält meist einen sogenannten Thermoblock, der in Sekundenbruchteilen große Temperaturunterschiede erzeugen kann.

Denaturierung

Während der Denaturierung (engl. melting) wird der Thermoblock auf 94 bis 96°C erhitzt, um ein Auflösen der die Doppelhelix zusammenhaltenden Wasserstoffbrückenbindungen zu erreichen. Am Ende der Denaturierungsphase sollten die DNA-Sequenzen und die Primer als Einzelstränge vorliegen.

Primerhybridisierung

Nach der Denaturierung wird der Block für 30 Sekunden auf eine Temperatur herunter gekühlt, die die Anlagerung (Annealing) der Primer an die DNA-Sequenz ermöglicht. Die passende Temperatur berechnet sich dabei nach der Länge der Primer, sie liegt in der Regel zwischen 55 und 65° C.

Elongation

Nachdem die Primer angelagert wurden, wird die Temperatur wieder erhöht, in diesem Fall auf die spezifische Arbeitstemperatur der DNA-Polymerase (zwischen 68 und 72° C), die jetzt beginnt, die DNA zu vervielfältigen. Die Primer werden hierbei nicht wieder aufgelöst, sondern bilden den Anfang des neuen DNA-Stranges. Die Dauer dieser Phase richtet sich wiederum nach der Länge des zu reproduzierenden Stranges, es werden in 30 Sekunden etwa 500 Basenpaare angelagert.

Nach Ablauf dieser Phase beginnt der Cycler einen neuen Zyklus, bei dem die Temperaturen wieder auf über 90 Grad Celsius erhöht werden, so dass sich alle Doppelstränge erneut trennen, um als Vorlage für  eine weitere Replikationsrunde zu dienen und so eine exponentielle Vervielfältigung ermöglichen. Es können bis zu 50 Zyklen durchgeführt werden (meist führt man 30 durch), am Ende kühlt der Cycler den Thermoblock auf 4° C herunter, um die fertiggestellten DNA-Sequenzen zu kühlen, bis sie weiter verarbeitet werden.

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