DNA-Synthese „live“ beobachten – neue Möglichkeiten in der Forschung

21.12.2011 | von Redaktion Pflanzenforschung.de

DNA-Sequen-zierungsmethoden: Neue Substanz „F-ara-EdU“ ermöglicht, entstehende DNA im lebenden Organismus zu markieren (Quelle: © istockphoto)

Wie läuft die DNA-Synthese ab? Wo findet sie in welchem Ausmaß statt, wie interagiert DNA mit anderen Makromolekülen? Beim Verständnis dieser grundlegenden Vorgänge ist die Forschung jetzt einen großen Schritt weitergekommen.

Forscher haben eine neue Substanz entwickelt, die es ermöglicht, entstehende DNA im lebenden Organismus zu markieren, so dass sie jederzeit geortet werden kann. Das Besondere daran: Die neue Substanz mit dem Namen „F-ara-EdU“ beeinträchtigt die DNA kaum in ihrer Funktion. Frühere Substanzen bewirkten aufgrund ihrer Toxizität oftmals einen Stopp der Zellteilung oder das Absterben der Zelle. In einem Experiment mit Zebrafischlarven konnten die Forscher jetzt die Synthese von markierter DNA „live“ von der allerersten Zelldifferenzierung bis zum Schlüpfen beobachten. Durch diese Art von Visualisierung in lebenden Organismen können in Zukunft Virusinfektionen und Krebsgewebe identifiziert werden, da hier eine besonders intensive Zellteilung stattfindet. Das kann einen großen Beitrag zur Entwicklung von Medikamenten leisten. Die Ergebnisse wurden jetzt im Fachmagazin „Proceedings of the National Academy of Sciences“ (PNAS) vorgestellt.

Bisherige Methoden
Es gibt diverse Methoden, um wichtige Moleküle im Organismus zu markieren und zu untersuchen. Bisherige Methoden sind zum Beispiel:

FiSH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung), das Einschleusen von mit einem fluoreszierenden Marker versehenen DNA-Bausteinen („Sonden“) in die DNA
Fluoreszierende Fusionsproteine, eine in-vivo-Methode, bei der die DNA des sogenannten „Grün-Fluoreszierenden Proteins“ (GFP) der Qualle Aequorea victoria mit der DNA des gesuchten Proteins verbunden („fusioniert“) und anschließend in den Organismus eingeschleust wird, der dann das gewünschte Protein nebst Fluoreszenz herstellt
DNA-Markierung mit Bromdesoxyuridin (BrdU), einem Nachweis über spezifische Antikörper, die an das anstelle des Thymidin eingebaute BrdU andocken. Dies geht aber erst, nachdem die DNA über Hitze oder Säure denaturiert, die Zellen also abgetötet wurden
Markierung („Staining“) von Nucleinsäuren mit fluoreszierenden Farbstoffen wie Acridinorange wird vor allem bei Mikroorganismen eingesetzt.

Bioorthogonale chemische Reaktionen
Bei den bisherigen Methoden kommt es oft prozessbedingt zu Störungen im Ablauf der Zellteilung bis hin zum Tod der Zelle. Bei der Markierung mit Bromdesoxyuridin (BrdU) müssen die Zellen generell abgetötet werden. Um Abläufe im lebenden Organismus weitgehend störungsfrei zu beobachten, wurden die sogenannten bioorthogonalen chemischen Reaktionen entwickelt. Hier wird ein künstliches Molekül (zum Beispiel ein künstliches Nukleosid) auf natürlichem Weg in eine Zielstruktur (zum Beispiel DNA) eingebaut. Dieses Molekül enthält eine spezielle funktionelle Gruppe („chemical reporter“, zum Beispiel Alkyne (—CnH2n-n). Wichtig ist hierbei, dass das Molekül mit seiner funktionellen Gruppe die natürlichen Abläufe der Zielstruktur nicht weiter beeinflusst („Bioorthogonalität“).

In einem zweiten Schritt wird die dazu komplementäre funktionelle Gruppe eingeschleust (zum Beispiel fluoreszierende organische Azide (—N3) und über eine sogenannte chemoselektive Reaktion. Dies bedeutet, dass nur die gewünschten funktionellen Gruppen miteinander reagieren. Durch die auftretende Fluoreszenz werden die künstlichen Moleküle von den natürlichen unterscheidbar und im lebenden Organismus identifizierbar. Bekannte chemoselektive Reaktionen sind die Staudinger Ligation und die sogenannte Click-Reaktion (eine künstliche Beschleunigung von in der Natur ablaufenden Reaktionen, wie zum Beispiel die Copper (I)-catalyzed azine-alkyne cycloaddition (CuAAC) oder die Copper-free-click-chemistry).

Bisherige Methoden riefen oft Störungen im Ablauf der Zellteilung hervor. Die neu entwickelte Substanz „F-ara-EdU“ beeinträchtigt die DNA kaum in ihrer Funktion. (Quelle: © istockphoto)

EdU und F-ara-EdU
Als künstliches Nukleosid im Rahmen der bioorthogonalen chemischen Reaktionen wurde bisher oft 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU) eingesetzt. 2'-Desoxyuridin (dU) unterscheidet sich nur minimal von Thymidin und wird daher bei der DNA-Synthese anstelle von Thymidin in die Erbsubstanz eingebaut. Die Ethynyl-Gruppen können anschließend über CuAAC mit einem fluoreszierenden Azid markiert werden. Damit sind diese im lebenden Organismus gut auffindbar. EdU wirkt ab einer bestimmten Konzentration allerdings stark toxisch, so dass bei einer längeren Beobachtungszeit oftmals eine Unterbrechung des Zellteilungszyklus auftritt.