Von KillerRed bis dTomato: Leuchtproteine erobern die Pflanzenforschung

Fluoreszierende Proteine aus Meerestieren haben die Erforschung zellulärer Prozesse revolutioniert. Mit ihnen lassen sich Proteine und sogar RNA-Moleküle im Nanobereich sichtbar machen und Zellen manipulieren. Auch in der Pflanzenforschung kommen sie mit immer ausgefeilteren Techniken zum Einsatz.

Als der Meeresbiologe Osamu Shimomura aus der Qualle Aequorea victoria das „green fluorescent protein“ (GFP) isolierte, ahnte er noch nicht, dass seine Entdeckungen zu einer wissenschaftlichen Revolution führen würden. Er wollte damals verstehen, warum die Pazifikqualle grün fluoreszierte, wenn man sie störte und entdeckte dabei das GFP, ein Molekül, das unter UV-Licht hell grün strahlte. 

Eine Revolution für die Zellbiologie

In den vergangenen Jahrzehnten erlangte das Molekül als grün fluoreszierender zellulärer Marker eine überragende Bedeutung für die medizinische und biologische Forschung. Die Neukombination von Genen im Labor machte es möglich, das Quallen-Gen in andere Gensequenzen einzubauen und damit tierische, pflanzliche und bakterielle Proteine grün aufleuchten zu lassen. 

Fast jedes Protein lässt sich heutzutage auf diese Weise an GFP koppeln und sichtbar machen. Dadurch kann beispielsweise beobachtet werden, ob zelluläre Proteine an die Zellmembran andocken oder in den Zellkern transportiert werden, wann sie auf- und abgebaut werden. Mit dem neuen, leuchtenden Gen lassen sich diese Prozesse sogar in Echtzeit in lebenden Zellen verfolgen und die Genaktivität kann bestimmten Organen zugeordnet werden. Mit ultraviolettem und blauem Licht lässt sich das GFP einfach durch Zellmembranen und Zellwände hindurch von außen anregen, ohne diese zu zerstören. 

Quallen verfügen über fluoreszierende Proteine, die sie im Dünkeln leuchten lassen. Forschern ist es gelungen, einige dieser Proteine zu isolieren (Quelle: © HaPi76 / pixelio.de).

Für ihre Entdeckung und Weiterentwicklung des GFP als Reportermolekül erhielten Osamu Shimomura und die Zellbiologen Martin Chalfie und Roger Tsien 2008 den Nobelpreis für Chemie. 

Neue Farben, neue Tricks 

Seit der Entdeckung des GFP hat die Anwendung von Leucht-proteinen eine rasante Entwicklung erlebt. Als die Proteinstruktur des GFPs bekannt wurde, machten sich Wissenschaftler bald daran, Aminosäuren in dem farbgebendem Chromophor-Komplex des Proteins auszutauschen und zu ersetzen. Bereits wenige Mutationen bewirkten, dass das GFP in anderen Wellenlängen des Farbspektrums strahlte. Auch wurden aus anderen Meerestieren neue fluoreszierende Reporter isoliert, wie beispielsweise das rot fluoreszierende Protein (RFP oder auch DsRed), das in der Koralle Discosoma striata entdeckt wurde. 

Mittlerweise gibt es über 50 GFP- und RFP-Varianten, die die gesamte Farbpalette des sichtbaren Lichts abdecken. Je nach Farbe heißen sie mCherry, dTomato, Citrine oder mBanana. Die diversen Farbschattierungen ermöglichen es, mehrere Proteine oder Zellorganellen gleichzeitig abzulichten. 

Einige der neuen Varianten besitzen darüber hinaus aber auch ganz neue Funktionen. Mit KillerRed aus der Anthomedusa-Qualle lassen sich Zellen beispielsweise per Lichtsignal abtöten. Werden Zellen, in denen KillerRed an einen Zellfaktor gekoppelt ist, mit Licht im gelben Wellenbereich bestrahlt, so produziert das Protein Sauerstoffradikale, die Zellorganellen angreifen und schließlich zum Tod der Zelle führen. Dieser Zelltod, der quasi per Fernsteuerung durch ein Lichtsignal eingeleitet werden kann, ist beispielsweise als mögliche Krebstherapie interessant, um Tumorzellen zu zerstören. 

Leuchtende Gene in der Pflanzenforschung

Auch in der Pflanzenforschung eröffnete das leuchtende Reporter-molekül ganz neue technische Möglichkeiten. Mit ihm ließen sich erstmals Proteine und Strukturen in lebenden Pflanzenzellen in hoher mikroskopischer Auflösung sichtbar machen und filmen. Mittels Fluoreszenzmikroskopie, bei der die Reporter durch Laser oder Licht aus einem bestimmten Wellenbereich zum fluoreszieren angeregt werden, lassen sich beispielsweise Transportprozesse von Hormonen an Wurzel und Sprossachse live verfolgen.

Ausbreitung der Transgeninaktivierung: Tritt bei GFP-exprimierenden Pflanzen (a) die Transgeninaktivierung auf, so beginnt dies als lokales Ereignis (b) wobei Ort und Zeitpunkt der Inaktivierung selbst bei genetisch identischen Pflanzen unterschiedlich sind. Silencing breitet sich mit der Zeit aus (c, d), sodass ganze Blätter (e) und schließlich die gesamte Pflanze betroffen sind. Dieser Prozess kann Tage bis Wochen dauern. (Quelle: © Schmidt / Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie).

Bei der Erzeugung gentechnisch veränderter Pflanzen wird GFP darüber hinaus genutzt, um Keimlinge oder Zellen auszuwählen, in denen die Übertragung fremder Gene erfolgreich geglückt ist und um bestimmte Zelltypen zu markieren. Mit der sogenannten Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)-Technik lassen sich GFP-markierte Zellen aus einer Pflanze gezielt isolieren. 

GFP als Biosensor

Unter Bestrahlung von UV-Licht, sind GFP-positive Pflanzen allerdings auch mit bloßem Auge in intakten Pflanzen im Gewächshaus auszumachen. Aus diesem Grund wird das Protein auch als Biosensor eingesetzt, um zu erforschen, wie Pflanzen auf Umweltreize reagieren. Dazu koppeln Pflanzengenetiker GFP an entsprechende Genschalter, die durch Signale aus der Umwelt ein oder ausgeschaltet werden. Werden beispielsweise Stressgene durch Kälte oder Trockenheit aktiviert, so beginnen bestimmte Pflanzenorgane grün zu fluoreszieren. GFP fungiert dabei auch als Indikator der Genaktivität und zeigt wo und wann bestimmte Stressgene in der Pflanze aktiv werden. 

Um GFP als Stress-Biosensor zu nutzen, entwickelten Wissen-schaftler sogar eine spezielle Stress-sensitive GFP-Variante. Das sogenannte redox-sensitive GFP (roGFP) reagiert auf die Anwesenheit reaktiver Sauerstoffradikale, die beispielsweise bei Trockenstress in Pflanzenzellen entstehen. Durch Einbau zweier Cystein-Aminosäuren in das ursprüngliche GFP, wechselt roGFP zwischen zwei Anregungswellenlängen. Werden die Cysteine durch Sauerstoffradikale oxidiert, verändert sich die Proteinstruktur des roGFP und es fluoresziert stärker bei einer Anregung mit blauem Licht von 400 Nanometer (nm). Befindet sich das Protein in nicht oxidiertem Zustand, benötigt man längerwelliges Licht von 490 nm, um eine maximale Fluoreszenz zu erreichen. Je nach dem Gehalt der schädlichen Sauerstoffradikale in der Zelle, fluoresziert das roGFP demnach entweder stärker bei der einen oder anderen Wellenlänge. In der Forschung wird diese Methode vor allem genutzt, um zu untersuchen, wie stressanfällig unterschiedliche Pflanzengewebe und Zellorganellen unter den verschiedensten Umweltbedingungen sind.