26.11.2008

Forschung Projekte

Erprobung eines Nematodenbiotests

(2005 – 2008) Institut für Biodiversität - Netzwerk e.V., Regensburg

Thema

In diesem Projekt wurde ein Biotest mit dem Nematoden Caenorhabditis elegans zum Nachweis von Bt-Toxinen geprüft. Der Test wurde mit der transgenen Maissorte Mon88017 entwickelt, die gegen den Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera virgifera) resistent ist.

Durch die Untersuchung von Umweltproben mit Hilfe des Nematodentests (Vergleich von transgenen mit isogenen Maissorten) soll die Einschätzung des Risikopotenzials einer Freisetzung von neuen Bt-Maissorten erleichtert werden.

Im letzten Versuchsjahr wurde die Zusammensetzung der Nematoden-Lebensgemeinschaft im Boden der verschiedenen Parzellen des Versuchsfelds untersucht.

Zusammenfassung

Nematodentest

Mit Boden-Material wurde kein Bt-Effekt gemessen. Dies wird darauf zurückgeführt, dass die Konzentrationen im Boden nie ein Nanogramm pro Gramm Boden Trockengewicht überstiegen. Im Labor wurden Effekte ab einer Konzentration von mehr als 36 Milligramm pro Liter beobachtet. D.h., dass die im Boden gemessenen Konzentrationen weit entfernt sind von den Konzentrationen, bei denen an den Nematoden ein Effekt beobachtet werden kann.

Auch bei den Tests mit den verschiedenen Blattmaterialien wurden keine Unterschiede im Nematodenwachstum gefunden.

Wirkmechanismus

Es gibt Hinweise darauf, dass das Bt-Toxin Cry3Bb1 nicht in gleicher Weise auf Nematoden wirkt, wie spezifisch gegen Nematoden wirksame (nematizide) Cry-Toxine. Allerdings scheinen Cry3Bb1 und auch Cry1Ab an für Cry-Proteine spezifische Rezeptoren zu binden.

Nematoden-Lebensgemeinschaften

In den Bodenproben wurden sehr viele Nematoden - zwei bis vier Millionen pro Quadratmeter - gefunden. An einem Probenahmetermin (Oktober 2007) zeigten sich zwischen Parzellen mit Bt-Mais und Parzellen mit isogenem bzw. konventionellem Mais signifikante Unterschiede in der Zusammensetzung der Nematodengattungen. Ein indirekte Wirkung des Bt-Proteins über das Bodennahrungsnetz kann nicht ausgeschlossen werden. Die Funktionalität der Nematodenlebensgemeinschaft wurde dadurch aber nicht beeinträchtigt.

Versuchsbeschreibung

Nematodentest

Für den Nematodentest wurden fünf junge Nematoden (C. elegans) des ersten Juvenilstadiums (J1) in eine wässrige Suspension bzw. Lösung des Testmaterials (Cry-Toxine, Pflanzen als Pulver, gesiebte Erde) eingesetzt. Nach vier Tagen – einem kompletten Generationszyklus bei zwanzig Grad – wurde der Test beendet.

Betrachtet wurden Wachstum und Reproduktion (Nachkommen pro Testorganismus) der Testorganismen.

Mit dem Test wurden folgende Materialien untersucht:

Blattmaterial. Es wurden alte, getrocknete Maisblätter und gefriergetrocknete Maisblätter getestet. Dabei wurde jeweils Blattmaterial von Bt-Mais (MON88017) und einer isogenen Sorte (DKC 5134) zur Verfügung gestellt. Bei den getrockneten Blättern wurde auch der Einfluss auf die Eiproduktion erfasst. Die getrockneten Blätter wurden mit Sand gemörsert. Es wurden zehn, fünfzig und hundert Milligramm Blatt/Sand-Gemisch untersucht. Die gefriergetrockneten Blätter wurden sehr fein püriert und dann gesiebt.

Cry3Bb-Toxin. Mit dem reinen Toxin wurden Dosis-Wirkungs-Versuche an zwei Nematodenstämmen – ein Stamm mit geringer und einer mit hoher Sensitivität gegenüber spezifisch gegen Nematoden wirksamen (nematiziden) Bt-Toxinen – durchgeführt. Das Toxin wurde von einem Verbundpartner zur Verfügung gestellt.

Boden vom Versuchsfeld (Wurzelanhangserde): Von jeder Parzelle der verschiedenen Maissorten (transgener Mais, isogene Sorte, sowie zwei weitere konventionelle Maissorten) wurde Wurzelanhangserde von zwei Maisentwicklungsstadien (zur Blüte, nach der Ernte) beprobt und mit dem Nematodentest untersucht.

Boden mit Pflanzenstreu (Mesokosmen): Aus dem Feldversuch wurden Bodenproben genommen und in Versuchscontainern (so genannten Mesokosmen) mit Pflanzenstreu von den vier verschiedenen Maissorten bestückt. Diese Mesokosmen wurden im Gewächshaus beobachtet und beprobt (AG Schuphan, RWTH Aachen). Bodenproben daraus wurden mit dem Nematodentest untersucht.

Wirkmechanismus

Zusätzlich wurde die Toxizität von Cry3Bb1 und Cry1Ab vergleichend mit den beiden Nematodenstämmen untersucht. Dadurch sollte überprüft werden, ob der Wirkmechanismus von Cry3Bb1 und Cry1Ab mit dem nematizider Bt-Toxine vergleichbar ist. In den Versuchen wurden beiden Nematodenstämmen drei verschiedene E-coli-Stämme als Futter angeboten (=Futterbakterien): zwei gentechnisch veränderte E-coli-Stämme, von denen einer das Cry3Bb1-Gen trägt und einer das Cry1Ab-Gen, sowie einer ohne gentechnische Veränderung. Die verschiedenen Bakterienstämme wurden den Nematoden in verschieden Dichten und Mischungsverhältnissen sowie unterschiedlich lang (16, 24, 48 Stunden) als Futter angeboten.

Anschließend wurden mit Hilfe der PCR zwei Gene (ttm-1 und ttm-2) aus den Nematoden betrachtet, die durch Expression von Enzymen zur „Verteidigung“ gegen Cry-Proteine beitragen. (Kooperation mit Ralph Menzel, HU Berlin)

Untersuchung von Nematoden-Lebensgemeinschaften

Zur Isolierung von Nematoden wurden 2007 kurz nach der Aussaat, zur Blüte und nach der Ernte von allen 32 Parzellen des Versuchsfeldes Bodenproben aus den oberen zwanzig Zentimetern genommen. Nach der Zählung der Nematoden wurden je fünfzig Individuen soweit möglich auf Artniveau bestimmt. Die Nematodenarten wurden gemäß ihrer Ernährungstrategie in verschiedene Ernährungstypen eingeteilt (Pflanzenfresser, Pilzfresser, Bakterienfresser, Räuber, Algenfresser, Allesfresser). Außerdem wurde ein speziell für Nematoden entwickelter Stress-Index, der Maturity Index berechnet.

Ergebnisse

Nematodentest

Vor Beginn des Projekts wurde der Nematodentest bereits an Bt-Mais, der gegen den Maiszünsler resistent ist (MON810), durchgeführt. Dabei erwies sich der Test als empfindlich gegenüber den transgenen Sorten.

Alte, getrocknete Blätter. Die Nematoden entwickelten sich mit zunehmender Menge an Pflanzenmaterial schlechter. Das gilt sowohl für Bt- als auch isogenes (Iso-) Pflanzenmaterial. Es wurde kein Unterschied im Wachstum zwischen Proben von Bt- und isogenem Mais gefunden.

Gefriergetrocknete Blätter. Mit dem gefriergetrockneten Blattmaterial konnten sich die Nematoden nicht entwickeln. Der feine Staub war anscheinend kein geeignetes Substrat für den Nematodentest.

Cry3Bb-Toxin. Gelöstes Cry3Bb1 zeigte eine deutliche toxische Wirkung auf C. elegans, wobei der EC50 (Konzentration bei der die untersuchten Parameter um 50% vermindert sind) für Wachstum und Reproduktion ungefähr bei dreißig Milligramm pro Liter lag (Abb. 1). Ein Unterschied zwischen den beiden Nematodenstämmen in ihrer Sensitivität gegenüber Cry3Bb1 konnte nicht gefunden werden (Abb. 1).

Boden vom Versuchsfeld (Wurzelanhangserde). Weder innerhalb der Maissorten noch zwischen den Maissorten wurden signifikante Unterschiede im Wachstum gefunden. (Abb.2).

Die Fertilität lag in allen untersuchten Proben bei hundert Prozent. Die Reproduktion schwankte innerhalb der Behandlungen stärker als zwischen den Maissorten (Abb.2). Im Mittel fanden sich am meisten Nachkommen in den Böden einer der beiden konventionellen Maissorten. Ein Bt-Effekt wurde also nicht gefunden.

Bedeutung der Toxizitätsdaten. Die Konzentrationen im Boden überstiegen nie ein Nanogramm pro Gramm Boden Trockengewicht. Im Flüssigmedium lag die Konzentration, bei der kein Effekt mehr beobachtet werden konnte (NOEC; no observed effect concentration) bei 36 Milligramm pro Gramm. D.h., dass die im Boden gemessenen Konzentrationen weit entfernt sind von den Konzentrationen, bei denen an den Nematoden ein Effekt beobachtet werden kann (s. Abb.6). Das erklärt, wieso in den Projektjahren 2005 und 2006 in den Bodenproben keine direkten Effekte des Cry3Bb1-Toxins auf C. elegans aufgetreten sind.

Boden mit Pflanzenstreu (Mesokosmen). Mit den Bt-Bodenproben war das Wachstum signifikant geringer als mit den Bodenproben der isogenen Linie. Dies ist allerdings auch für die beiden konventionellen Sorten zu beobachten. Ein eindeutiger Bt-Effekt lässt sich daher nicht zeigen.

In allen untersuchten Proben war die Fertilität von C. elegans größer als neunzig Prozent. Auch bei der Reproduktion zeigten sich keine Bt-Effekte. Die Erklärung dafür liegt höchst wahrscheinlich, wie bei den Bodenproben vom Versuchsfeld, bei den sehr niedrigen Toxin-Konzentrationen im Boden.

Wirkmechanismus

Auch Fütterungsversuche mit transgenen E. coli, die das Toxin produzieren, zeigten keine erhöhte Sensitivität eines Bt-sensitiven Stammes gegenüber Cry3Bb1. Dies ist ein Hinweis darauf, dass Cry3Bb1 nicht über den Wirkungsmechanismus der nematiziden Cry-Toxine wirkt.

Aus vorherigen Versuchen mit Cry1Ab-produzierenden E.coli wird vermutet, dass Cry1Ab dagegen mit dem gleichen Mechanismus wirkt wie nematizide Cry-Toxine. (Cry5A; Cry14A; Cry21A). Die Toxizität von Cry1Ab und Cry3Bb1 auf C. elegans liegt allerdings um mehr als zwei Größenordnungen niedriger als die der nematiziden Cry-Proteine.

In Anwesenheit von Cry1Ab wurden die ttm-Gene zur Verteidigung stärker abgelesen. In Anwesenheit von Cry3Bb1 war das nur bei ttm-2 der Fall. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass Cry1Ab und Cry3Bb1 an für Cry-Proteine spezifische Rezeptoren binden können.

Untersuchung von Nematoden-Lebensgemeinschaften

In den Bodenproben wurden sehr viele Nematoden – zwei bis vier Millionen pro Quadratmeter – gefunden (Abb.3). Über den Beobachtungszeitraum nahmen die Zahlen leicht ab. Die Lebensgemeinschaften wurden in allen Parzellen und zu beiden Zeitpunkten von Pflanzen- und Bakterienfressern dominiert. Die Zusammensetzung der Ernährungstypen und die Diversität der Lebensgemeinschaften unterschieden sich weder zwischen den Probenahmezeitpunkten noch zwischen den Maissorten (Abb.4). Beim letzten Probenahmetermin (Oktober 2007) zeigten sich allerdings zwischen Parzellen mit Bt-Mais und Parzellen mit isogenem bzw. konventionellem Mais signifikante Unterschied in der Zusammensetzung der Nematodengattungen (Abb.5). Auf Grund der niedrigen Konzentrationen an Cry3Bb1 im Boden und den vergleichsweise hohen Toxizitätsschwellenwerten (Abb.6) ist es unwahrscheinlich, dass direkte Effekte des Toxins die Änderungen bei den Nematodenlebensgemeinschaften hervorgerufen haben. Indirekte Effekte über das Bodennahrungsnetz können allerdings nicht ausgeschlossen werden. Die Funktionalität der Nematodenlebensgemeinschaft wurde aber durch die Änderungen nicht beeinträchtigt (keine Effekte auf Maturity Index und Channel Index).