21.01.2009

Forschung Projekte

Untersuchungen zur Aktivierung von Bt-Toxinen im Maiswurzelbohrer

(2005 – 2008) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) (seit 2008 Julius Kühn-Institut (JKI)), Institut für biologischen Pflanzenschutz, Darmstadt

Thema

Wenn Bt-Mais angebaut wird, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Resistenzentwicklung der Maisschädlinge gegenüber dem jeweils wirksamen Bt-Toxin.

In diesem Projekt wurden Testsysteme erstellt, die im Falle einer Resistenzentwicklung des Maiswurzelbohrers (diabrotica v. virgifera) zur Aufklärung möglicher Resistenzmechanismen herangezogen werden können.

Um den Ansatz der Untersuchungen verstehen zu können, ist der Wirkungsmechanismus von Bt-Toxinen von Bedeutung: Bei den Bt-Toxinen handelt es sich um Proteine. Diese Proteine werden vom Insekt mit der Nahrung aufgenommen und im Verdauungstrakt gelöst. Mittels spezieller Enzyme des Darmsaftes, so genannter Proteasen, werden sie gekürzt und dann an spezifische Rezeptoren der Darmwand gebunden. Schließlich kommt es zur Integration in die Darmwand und zur Bildung von Poren. Dadurch wird die Darmwand perforiert, was zum Tod des Insekts führt.

Die Resistenz von Insekten gegenüber Bt-Toxinen kann an jedem dieser Schritte ansetzen. Die bisher beschriebenen Resistenzen gegen Bt-Toxine sind meist protease- oder rezeptorbedingt. Daher wurde untersucht, welche Proteasen im Darmsaft des Maiswurzelbohrers aktiv sind und welche der nachgewiesenen Proteasen an dem Abbau des Bt-Toxins beteiligt sind. Weiterhin wurde die Bindung wirksamer Bt-Toxine an die Rezeptoren der Darmwand untersucht.

Zusammenfassung

Im Darmsaft des Maiswurzelbohrers wurden eine ganze Reihe verschiedener Proteasen nachgewiesen. Diese Proteasen sind bei vielen Käfern – wie auch dem Maiswurzelbohrer – für den Proteinabbau verantwortlich.

Von den im Darmsaft vorhandenen Proteasen bauten die käuflichen Proteasen Trypsin, Elastase und Papain einzeln im Test das Cry3Bb1-Protein ab. Die übrigen Proteasen bauten das Bt-Toxin nicht ab. Bei Tests mit Darmsaft aus dem Maiswurzelbohrer wurden Cry3Bb1 sowie zwei weitere Bt-Toxine (Cry34Ab1 und Cry35Ab1) jedoch nicht abgebaut. Daher wird die Wahrscheinlichkeit einer protease-bedingten Resistenz gegenüber den untersuchten Bt-Toxinen als gering eingestuft.

Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden die spezifischen Bindungsplätze in der Darmwand für die Bt-Toxine charakterisiert.

Versuchsbeschreibung

Da sich der Wirkungsmechanismus von Bt-Toxinen im Darmkanal der Insekten abspielt, wurden für die Untersuchungen Mitteldärme von Larven benötigt, die von einem Verbundpartner (BTL Bio-Test Labor, Sagerheide) angezogen und präpariert wurden. Aus den Mitteldärmen wurde bei der BBA Darmsaft bzw. Darmwand-Material gewonnen.

Zunächst wurde der pH-Wert des Darmsaftes gemessen, da die Aktivität der Toxin abbauenden Enzyme (Proteasen) vom pH-Wert abhängig ist. Da der pH-Wert in verschiedenen Darmbereichen unterschiedlich sein kann, wurde zusätzlich der pH-Wert unterschiedlicher Darmabschnitte bestimmt. Dazu wurden 170 Mitteldärme in vordere, mittlere und hintere Abschnitte geteilt und der pH-Wert des jeweiligen Darmsaftes gemessen.

Nachweis von Protease-Aktivitäten

Zur Identifizierung der im Darmsaft des Maiswurzelbohrers aktiven Proteasen wurden photometrische Tests mit spezifischen Substraten und spezifischen Protease-Inhibitoren durchgeführt.

Verdünnung des Darmsaftes. Bei einem Auftreten von resistenten Tieren ist es wünschenswert, mit einer möglichst geringen Menge an Darmsaft arbeiten zu können, da größere Mengen an Mitteldärmen erst nach längerer Vermehrungsphase zur Verfügung stehen. Daher wurden zusätzlich Verdünnungsversuche durchgeführt. Damit wurde getestet, mit welcher maximalen Verdünnung noch ein sicherer Nachweis der jeweiligen Protease durchgeführt werden kann.

Abbau und Bindung des Toxins

Abbau. Zur Klärung des Abbaus des Toxins wurden Darmsaft bzw. die nachgewiesenen Enzyme mit dem Toxin zusammengegeben und die Abbauprodukte elektrophoretisch charakterisiert.

Bindung. Um die Bindung des Bt-Toxins an die Darmwand zu untersuchen, wurde markiertes Bt-Toxin zu isolierten Darmwandabschnitten gegeben. Auf diese Weise wurden die an der Bindung beteiligten Rezeptoren charakterisiert. Das Bt-Toxin wurde von der Firma Monsanto zur Verfügung gestellt.

Ergebnisse

Die pH-Werte der Darmsaft-Proben waren auffallend homogen. Sie lagen im leicht sauren Bereich (im Mittel pH 5,75). Bei der Untersuchung der unterschiedlichen Mitteldarmbereiche zeigte sich eine leichte Zunahme des pH-Werts vom vorderen zum hinteren Abschnitt (pH 5,75 bis 6,03). Allerdings waren die Standardabweichungen teilweise höher als die Unterschiede zwischen den Darmabschnitten.

Nachweis von Protease-Aktivitäten

Im Darmsaft von L3-Larven des Maiswurzelbohrers wurden verschiedene Proteasen nachgewiesen, wobei besonders Proteasen berücksichtigt wurden von denen bekannt ist, dass sie bei vielen Käfern – z.B. den Chrysomeliden, zu denen auch der Maiswurzelbohrer gehört – für den Proteinabbau verantwortlich sind.

Beim Wurzelbohrer wirkt ein anderer Inhibitor auf Trypsin als beim Maiszünsler. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass bei diesen Insekten unterschiedliche Trypsin-Typen wirksam sind.

Verdünnung des Darmsafts. Der Nachweis einzelner Proteasen war auch mit bestimmten Verdünnungen des Darmsaftes noch möglich.

Abbau und Bindung des Toxins

Abbau. Unter den nachgewiesenen Proteasen bauten die käuflichen Proteasen Trypsin, Elastase und Papain einzeln im Test das Cry3Bb1-Protein ab. Die übrigen Proteasen bauten das Bt-Toxin nicht ab. Im Gegensatz zu den Einzeltests mit käuflichen Proteasen wurde das Cry3Bb1-Protein mit Darmsaft aus dem Maiswurzelbohrer nicht abgebaut. Auch die Bt-Toxine Cry34Ab1 und Cry35Ab1 wurde mit Diabrotica-Darmsaft nicht abgebaut.

Bindung. Die Bindungsstudien mit den Bt-Toxinen Cry3Bb1 und Cry34Ab1/Cry35Ab1 zeigten, dass diese gegen den Maiswurzelbohrer wirksamen Toxine um Bindungsplätze – also spezifische Rezeptoren der Darmwand – konkurrieren. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden auch die spezifischen Rezeptoren charakterisiert.