Bindung von Bt-Proteinen an Bodenpartikel

(2008 – 2011) Institut für Angewandte Biotechnologie der Tropen (IBT) an der Georg-August-Universität Göttingen

Thema

In diesem Projekt wurde untersucht, wie sich der Anbau von gentechnisch verändertem Mais (Bt-Mais MON89034xMON88017), der drei verschiedene Bt-Proteine bildet, auf den Boden der Anbaufläche auswirkt. Die Bt-Proteine aus den Maispflanzen gelangen über Wurzelausscheidungen, Ernterückstände und Polleneintrag in den Boden und werden dort an Bodenpartikel gebunden. Die Bindung (Sorption) an Bodenpartikel hemmt teilweise den Abbau der Bt-Proteine, so dass ihre insektizide Wirkung erhalten bleibt. Das könnte dann die Humusbildung beeinflussen und die Zusammensetzung der organischen Substanz im Boden verändern.

Folgende Fragestellungen wurden bearbeitet:

  • Welches sind die chemisch-physikalischen Eigenschaften der Bodenfraktionen der Freisetzungsfläche?
  • Werden Bt-Proteine über die Wurzeln in den Boden abgegeben?
  • Welches Bindungsverhalten zeigen die Bt-Proteine gegenüber den Bodenfraktionen der Freisetzungsfläche?
  • Konkurrieren die drei Bt-Proteine um Bindungsplätze im Boden?

Zusammenfassung

Von allen Parzellen des Versuchsfeldes wurden Bodenproben entnommen und auf ihre chemischen Eigenschaften und ihre mineralogische Zusammensetzung untersucht. Als Bodentyp lag eine Bänderparabraunerde vor. Die Böden des Freisetzungsstandortes waren insgesamt sehr homogen.

Es wurde nachgewiesen, dass über die Maiswurzeln alle drei Bt-Proteine kontinuierlich in die Böden gelangen.

Die Untersuchung des Bindungsverhaltens der Bt-Proteine gegenüber den Bodenfraktionen der Freisetzungsfläche zeigte, dass die Bt-Proteine am ehesten an Tonpartikel im Boden binden. Das Cry3Bb1-Protein wurde von allen drei Proteinen am stärksten gebunden. Es konnte keine Konkurrenz um Bindungsplätze zwischen den Proteinen Cry1A.105 und Cry2Ab2 festgestellt werden.

Versuchsbeschreibung

Charakterisierung der Böden

In den Vorläuferprojekten konnte gezeigt werden, dass die Bindung der Bt-Proteine an Bodenpartikel maßgeblich von der Struktur und den chemischen Eigenschaften der Tonpartikel im Boden einerseits und der Bt-Proteine andererseits beeinflusst wird. Da in diesem Projekt eine neue gentechnisch veränderte Maissorte auf einer anderen Freisetzungsfläche untersucht wurde, mussten als Grundlage für weitere Untersuchungen zunächst die Böden und anschließend die Bt-Proteine hinreichend charakterisiert werden.

Boden Göttingen

Probenahme der Böden auf dem Versuchsfeld

Maispflanzen

Anzucht der Maispflanzen in der Klimakammer zur Gewinnung der Wurzelausscheidungen

In drei Parzellen wurden Profilgruben mit einer Tiefe von 1,5 Meter angelegt, um das Bodenprofil freizulegen.

Von allen Parzellen des Versuchsfeldes wurden Bodenproben aus unterschiedlichen Tiefen (Oberboden 0-20 cm, Unterboden 40-60 cm) entnommen und auf ihre chemischen Eigenschaften und ihre mineralogische Zusammensetzung untersucht. Um einen möglichen Einfluss des Bt-Maises auf die Zersetzung der Maisstreu zu untersuchen, wurde der Gehalt an mineralischem Stickstoff bestimmt. Dazu wurden 2008 und 2009 jeweils im Frühjahr vor Beginn der Aussaat und der ersten Düngung Bodenproben aus dem Oberboden entnommen.

Untersuchung von Wurzelausscheidungen

Gentechnisch veränderte Pflanzen wurden in einer Nährlösung angezogen. In dieser Nährlösung wurde mit Hilfe der Nachweismethode ELISA die Konzentration der Bt-Proteine zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Hiermit wurde erfasst, ob und wann die Bt-Proteine über die Maiswurzel in den Boden gelangen.

Sorptionsmessungen

Die kleinsten Teilchen der Böden (Fraktion < 2 Mikrometer, Tonfraktion) sind durch die höchste Bindungskapazität gekennzeichnet. Daher wurden exakte Mengen an Ton bzw. Feinerde zusammen mit einer Lösung aus Bt-Protein für dreißig Minuten geschüttelt. Nachdem der Boden durch Zentrifugieren abgetrennt worden war, wurde anschließend die Konzentration des Bt-Proteins in der überstehenden Lösung gemessen. Der Versuch wurde mit allen drei Bt-Proteinen sowie mit verschiedenen Ausgangskonzentrationen an Bt-Protein durchgeführt. Diese Konzentrationen entsprachen denen, die in den Wurzelausscheidungen gemessen wurden.

Um zu überprüfen, ob Bt-Proteine um Bindungsplätze konkurrieren, wurden weitere Sorptionsmessungen mit Lösungen, die die Bt-Proteine Cry1A.105 und Cry2Ab2 enthielten, durchgeführt.

Produktion von Antikörpern

Im Rahmen des Projektes wurden neue Antikörper gegen die verschiedenen Bt-Proteine entwickelt und hergestellt. Mit diesen Antikörpern wurde ein spezieller ELISA-Test entwickelt und optimiert. Außerdem wurden diese Antikörper weiteren Arbeitsgruppen des Forschungsverbundes zur Verfügung gestellt.

Ergebnisse

Charakterisierung der Böden

Als Bodentyp lag eine Bänderparabraunerde vor. Die Böden des Freisetzungsstandortes waren insgesamt sehr homogen:

  • Die pH-Werte des Oberbodens lagen in einem für Ackerstandorte typischen Bereich. Die pH-Werte des Unterbodens waren höher als im Oberboden, was auf eine von oben nach unten fortschreitende natürliche Versauerung zurückzuführen ist.
  • Die Tongehalte lagen im Oberboden bei 6,4 Prozent und im Unterboden bei 5,8 Prozent. Bt-Proteine werden bevorzugt von Partikeln der Tonfraktion gebunden. Diese Partikel sind sehr klein und besitzen in ihrer Gesamtheit, der Tonfraktion eines Bodens, eine sehr große Oberfläche. Tonteilchen haben eine Korngröße von kleiner als 0,002 Millimetern (= 2 Mikrometer).
  • Der Gehalt an organischer Substanz in der Tonfraktion lag im Oberboden bei 5,4 Prozent und im Unterboden bei 2,4 Prozent. Die organische Substanz verschließt kleine Poren zwischen den Bodenpartikeln, so dass Bt-Proteine nicht an den Partikeloberflächen in den Porenzwischenräumen gebunden werden können.
  • Innerhalb der Parzellen gab es keine großen Unterschiede in der negativen Oberflächenladung der Schluff- und Tonpartikel. Dennoch wurde mehr Bt-Protein gebunden, je geringer die negative Ladung der Bodenpartikel war.

Die Stickstoff-Gehalte der Böden waren im Versuchsjahr 2009 etwas geringer als 2008. Die statistische Auswertung ergab keinen signifikanten Einfluss der Maissorte auf die Gehalte an mineralischem Stickstoff in den Böden.

Untersuchung von Wurzelausscheidungen

In den Laborversuchen konnte gezeigt werden, dass der Bt-Mais MON88017 x MON89034 über den untersuchten Wachstumszeitraum kontinuierlich alle drei Bt-Proteine bildet und über die Wurzeln in den Boden abgibt. Es ist davon auszugehen, dass die Bt-Proteine auch auf dem Feld kontinuierlich in den Boden gelangen. Mit zunehmender Pflanzenkulturdauer nahm die Ausscheidungsrate ab.

Adsorption der Cry-Proteine an die Tonfraktion

Bindung der drei Bt-Proteine an den Tonpools des Ober- (OB) und Unterbodens (UB)

Sorptionsmessungen

Wegen der geringen Tongehalte wurden Proben nach Ober – und Unterboden getrennt in drei Tonpools, also Sammelproben, aufgeteilt. Die Tonfraktion ist die bindungsaktivste Komponente der Böden. Dafür ist die große Oberfläche dieser Fraktion verantwortlich.

Das Bt-Protein Cry2Ab2 wurde an der Tonfraktion des Oberbodens durchweg stärker gebunden als an der jeweiligen Unterbodenprobe. Im Gegensatz dazu wurde das Cry1A.105-Protein eher im Unterboden gebunden. Das Cry3Bb1-Protein zeigte keine ausgeprägte Präferenz, wurde aber von allen drei Proteinen am stärksten gebunden.

Es konnte keine Konkurrenz um Bindungsplätze zwischen den Bt-Proteinen Cry1A.105 und Cry2Ab2 festgestellt werden.

Produktion von Antikörpern

Zur Herstellung von Antikörpern wurden Ziegen gegen die drei Bt-Proteine immunisiert. Aus dem Serum wurden die Antikörper gewonnen und aufgereinigt. Dabei erhält man polyklonale Antikörper, d.h. verschiedene Antikörper, die gegen dasselbe Protein gerichtet sind. Monoklonale Antikörper gegen die Bt-Proteine Cry1A.105 und Cry2Ab2 wurden mit Hilfe von Antikörper-produzierenden Zellen gewonnen.