23.07.2012

Forschung Projekte

Transgene Zitterpappeln: Überprüfung der Zuverlässigkeit männlicher Sterilitätssysteme

(2008 – 2011) Johann Heinrich von Thünen-Institut, Institut für Forstgenetik Großhansdorf

Thema

Bereits seit einigen Jahren wird über eine Verwendung gentechnisch veränderter Pappeln im kommerziellen Plantagenanbau, zum Beispiel als nachwachsende Rohstoffe, diskutiert. Bei der Sicherheitsbewertung gentechnisch veränderter Pflanzen spielt die mögliche Übertragung der neu eingeführten Gene über Pollen oder Samen eine wichtige Rolle. Weltweit werden daher Strategien entwickelt, die sich damit befassen, wie sich der Gentransfer durch Pollen oder Samen gezielt verhindern lässt (biologisches Confinement).

In diesem Teilprojekt sollte die Zuverlässigkeit eines für die Zitterpappel entwickelten Confinement-Systems überprüft werden. Untersucht wurden transgene Zitterpappeln aus einem Vorläuferprojekt. Sie enthielten Genkonstrukte, die eine männliche Sterilität hervorrufen sollten. Die verwendeten Gene enthalten die Informationen für bestimmte Zytotoxine (Zellgifte) und andere zellschädigende Substanzen. Durch die Wahl gewebespezifischer Steuerelemente (Promotoren) sollte erreicht werden, dass die Expression dieser Gene nur in den Antheren (Staubbeuteln) erfolgt.

Folgende Fragestellungen wurden untersucht:

• Wird Pollen gebildet?
• Ist eventuell gebildeter Pollen keimfähig?
• Werden die Sterilitätskonstrukte ausschließlich in den Antheren oder auch in anderen Geweben wie Blatt, Spross oder Wurzel exprimiert?

Vorläuferprojekt:

Informationen zum Verfahren:

Zusammenfassung

Ergebnisse mit einem der verwendeten Sterilitätskonstrukte deuten daraufhin, dass es einen Genfluss deutlich reduzieren könnte.

Es wurde ein Promotor gefunden, der für eine gezielte Genexpression in den Pappelblüten verwendet werden kann.

Es konnte ein natürlicherweise frühblühender Pappelklon identifiziert werden, der als Modellpflanze für weitere Untersuchungen der biologischen Sicherheit uneingeschränkt verwendet werden kann.

Versuchsbeschreibung

Untersucht wurden etwa zweihundert transgene, im Gewächshaus kultivierte Zitterpappeln aus einem Vorläuferprojekt. Sie sind mit sechs verschiedenen Genkonstrukten ausgestattet, bei denen insgesamt vier verschiedene Zytotoxingene und vier verschiedene Promotoren zum Einsatz kommen. Da Pappeln üblicherweise erst nach acht Jahren blühen, enthält ein Teil dieser Linien zusätzlich ein „Frühblühgen“.

Molekularbiologische Untersuchungen

Mit Hilfe von PCR und Southern Blot sollten zunächst die Orte im Pflanzengenom, an denen ein Genkonstrukt eingebaut wurde, untersucht werden.

Weiterhin wurde geprüft, ob die eingeführten Gene, wie gewünscht, nur in den Antheren exprimiert werden oder auch in anderen Geweben. Dazu benutzt man eine besondere Form der PCR (RT-PCR), die die Kopienzahl spezifischer RNA-Sequenzen misst und Rückschlüsse darauf erlaubt, ob und wie stark ein Gen exprimiert wird.

Mikroskopische Untersuchungen und Keimfähigkeitstests

Die transgenen Pappeln wurden ganzjährig auf ihre Blütenbildung hin untersucht. Alle Blüten wurden vor der Pollenreifung eingetütet, sodass sich eventuell fruchtbarer Pollen nicht ausbreiten konnte. Mit Hilfe mikroskopischer Untersuchungen und Anfärbung der Blüten wurde die Anwesenheit von Pollen überprüft und quantifiziert.

Die Keimfähigkeit des geernteten Pollens wurde entweder direkt durch Kreuzung mit weiblichen Narben getestet oder durch Aufbringen des Pollens auf Agar-beschichtete Objektträger. Die gegebenenfalls aus der Kreuzung erhaltenen Sämlinge wurden anschließend molekular analysiert.

Ergebnisse

Die Untersuchungen an transgenen frühblühenden Pappeln, die mit sieben verschiedenen Sterilitätskonstrukten transformiert wurden, zeigten, dass ein Genkonstrukt eindeutig sterile Blüten hervorbrachte. Die Aktivität des Sterilitätsgens wurde in Blütenknospen mit RT-PCR nachgewiesen. Die Untersuchungen zeigten, dass 68 Prozent der Blüten pollenfrei waren. Bei den restlichen Blüten waren die Pollenkörner vital und bestäubungsfähig.

Zwei Sterilitätskonstrukte haben keine erkennbaren Auswirkungen auf das Wachstum der Pflanzen gezeigt, zwei Konstrukte verursachten Wuchshemmungen bei den transgenen Pappeln. Bei den verbliebenen zwei Sterilitätskonstrukte haben die transgenen Pflanzen nicht geblüht.

Es konnten die Auswirkungen verschiedener Sterilitätskonstrukte auf die Antheren- und Pollenentwicklung untersucht werden. Die Antheren beinhalteten entweder keine oder nur sehr wenige Pollenkörner. Auf Basis von drei verschiedenen Vitalitäts-Tests wurde gezeigt, dass ein Teil der gebildeten Pollenkörner lebensfähig waren.

Die Verwendung einer natürlicherweise frühblühenden Pappellinie war für die schnellere Evaluierung von Sterilitätskonstrukten besser geeignet als bisher vorliegende transgene frühblühende Modelle. Für eventuelle weitere Biosicherheitsstudien wäre daher dieser Klon bisher am geeignesten.