Sterile Pappeln verhindern die Auskreuzung in forstliche Ökosysteme

(2001 – 2005) Bundesforschungsanstalt für Forst- und Holzwirtschaft (BFH), Institut für Forstgenetik und Forstpflanzenzüchtung, Großhansdorf

Thema

Gentechnisch veränderte Bäume werden in einigen Jahren einer kommerziellen Anwendung zur Verfügung stehen. Ihr Einsatz wird bevorzugt im Plantagenanbau zu erwarten sein.

Im Rahmen der Sicherheitsbewertung gentechnisch veränderter Gehölze ist eine mögliche Ausbreitung der Transgeneüber die Auskreuzung von Pollen und die Verbreitung von Samen zu berücksichtigen. Um sicherzustellen, dass sich Transgene nicht in natürlichen Waldbaumpopulationen verbreiten, werden Sterilitätskonzepte für Gehölze entwickelt.

Da keine konventionellen Strategien zur Erzeugung und Einkreuzung natürlicher Sterilität vorliegen, ist die gentechnisch vermittelte männliche und/oder weibliche Sterilität ein wichtiger Ansatz.

Im vorliegenden Projekt sollte ein gentechnischer Ansatz - Erzeugung männlicher und weiblicher Sterilität durch Verwendung verschiedener Genkonstrukte - modellartig an der Zitterpappel entwickelt werden. Es stellten sich insbesondere folgende Fragen:

  • Sind die bereits in krautigen Pflanzen geprüften Sterilitätsmechanismen auch in Zitterpappeln funktionstüchtig?
  • Können überlebensfähige transgene sterile Linien für einen Freisetzungsversuch im Gewächshaus selektiert werden?
  • Kann eine stabile Expression der Sterilitätsgene langfristig gewährleistet werden?

Zusammenfassung

Im Rahmen dieses Projekts ist es gelungen, transgene früh blühende Aspen zu erzeugen und sie mit verschiedenen Sterilitäts-Genkonstrukten auszustatten. Weibliche mit Sterilitätsgenen ausgestattete Pflanzen wurden bereits im Jahr 2002 ins Gewächshaus überführt. Männlich-sterile Linien folgten im Frühjahr 2003. Mehrere dieser Linien haben im Labor geblüht und wurden hinsichtlich der Expression der Sterilitätskonstrukte untersucht. Damit ist bereits eines der wichtigsten Ziele des Projekts erreicht worden, obwohl genauere Untersuchungen zur Genaktivität der Sterilitätsgene in Pappeln noch ausstehen.

Alternative Varianten zur Blühförderung, beispielsweise die Behandlung von Pappeln mit Hormonen bzw. Wachstumshemmern, haben bisher keine blühfördernde Wirkung gezeigt. Diese Pflanzen werden zukünftig aber weiter hinsichtlich ihrer Blühfähigkeit überprüft.

Versuchsbeschreibung

Baumarten beginnen im Vergleich zu einjährigen krautigen Pflanzen erst nach vielen Jahren zu blühen. Um den Zeitraum bis zur Blüte zu verkürzen, werden als Ausgangsmaterial transgene Aspen- (Pappel-) Linien verwendet, die bereits nach einigen Monaten bis drei Jahren blühen. Üblicherweise blühen Pappeln erst nach acht Jahren.

Transgene früh blühende Aspenlinien

Im Rahmen des Forschungsprojektes wurde zunächst auf vorhandene transgene Aspen-Linen zurückgegriffen, die das rolC-Gen (‚root-locus’ C-Gen) tragen und in Gewächshaus und Freiland vielfach untersucht wurden. Das rolC-Gen stammt aus dem Bodenbakterium Agrobacterium rhizogenes und verursacht phänotypische Veränderungen bei den transgenen Pflanzen. So ist vor allem der Zwergwuchs und die verfrühte Blütenbildung typisch für diese transgene Pflanze.

Zusätzlich wurden gentechnisch veränderte Aspen-Linien erzeugt, die ein „Frühblühgen“ aus der Birke (BpMADS4), das Leafy-Gen aus Arabidopsis, das rolD-Gen aus Agrobacterium rhizogenes oder das XX-Gen (Bezeichnung geändert) aus Arabidopsis tragen.

Darüber hinaus wurden Ansätze überprüft, bei denen die Pappeln mit verschiedenen Wachstumsregulatoren bzw. Wachstumshemmern behandelt wurden, um eine frühe Blüte zu induzieren.

Gentechnische Einführung von Sterilitätsgenen

Durch die Übertragung von Genkonstrukten mit verschiedenen Sterilitätsgenen in transgene früh blühende bzw. in nicht-transgene Kontrollpflanzen wurden verschiedene Strategien zur Sterilität getestet. Die Konstrukte trugen gewebespezifische Steuerelemente (Promotoren). Die hierfür verwendeten Promotoren bewirkten nur in bestimmten Pflanzenteilen eine zur Sterilität führende Genexpression, beispielsweise im Pollen, in der Narbe oder dort, wo die Pollenbildung stattfindet, in den Pollensäcken (Tapetum).

Die gentechnisch veränderten Pflanzen sollten direkt nach der Transformation ins Gewächshaus überführt werden, damit eine mögliche verfrühte Blütenbildung untersucht werden konnte. Auch war geplant, früh blühende transgene Linien im Labor zu kultivieren.

Ergebnisse

Männliche Blüte bei einer frühblühenden transgenen Pappellinie, in vitro. Um den Zeitraum bis zur Blüte zu verkürzen, wurden Pflanzen erzeugt, die ein

Männliche Blüte bei einer früh blühenden Leafy-transgenen Pappellinie, in vitro

Weibliche Blüte bei einer früh blühenden Leafy-transgenen Pappellinie, in vitro

Männliche Einzelblüten bei einer früh blühenden XX-transgenen Pappellinie, in vitro

Weibliches Kätzchen bei einer früh blühenden rolC-transgenen Pappellinie im Gewächshaus

Männliches Kätzchen bei einer nicht-transgenen Pappellinie

Transgene früh blühende Aspenlinien

Transformationen mit den „Frühblühkonstrukten“ (BpMADS4, Leafy, rolD,XX) wurden erfolgreich durchgeführt und die transgenen Pflanzenlinien ins Gewächshaus überführt. Die Förderung der Blühfähigkeit, die ursprünglich mit dem rolC-Gen geplant war, wurde mit der Verwendung des Leafy- sowie des XX-Gens eindeutig verbessert. Die Leafy- und XX-transgenen Pappeln haben bereits nach zwei bis zwölf Monaten geblüht und zeigten damit die beste Blühförderung verglichen mit den für die rolC- transgenen Pappellinien üblichen drei bis vier Jahren und den für „normale“ Pappeln üblichen mindestens acht Jahren.

Gentechnische Einführung von Sterilitätsgenen

Bisher wurden in diesem Projekt Sterilitätsgene in normal blühende und in früh blühende Leafy-transgene Pflanzen übertragen.

Die Übertragung von Sterilitätsgenen in normal blühende Pappeln war erfolgreich. Weibliche Pflanzen mit den Sterilitätsgenen BpMADS1::Barnase wurden bereits im Jahre 2002 ins Gewächshaus überführt.

Aufbauend auf den bisherigen Ergebnissen wurden früh blühende (mit dem 35S::Leafy-Konstrukt) männlich-sterile Linien erzeugt, die bereits mittels Southern-Analysen getestet wurden. Mehrere dieser Linien haben in-vitro geblüht und wurden hinsichtlich der Expression der Sterilitätskonstrukte untersucht.

Die Leafy-transgenen Pappeln haben jedoch nur Einzelblüten (keine Kätzchen) hervorgebracht, zeigten ein gestörtes Wachstum sowie eine klonabhängige Fertilität. Daher war die Suche nach Alternativen zur Induktion einer frühen Blütenbildung sinnvoll. Neue Untersuchungen haben ergeben, dass die Verwendung des XX-Gens aus Arabidopsis in Pappeln eine deutlich bessere Förderung der Blütenbildung ermöglicht. XX-transgene Pappeln blühen genauso frühzeitig wie Leafy-transgene Pappeln, haben aber den Vorteil, dass sie vollständige Kätzchen anstatt einzelner Blüten bilden. Transformationen mit diesem XX-Gen wurden im Dezember 2004 im Rahmen dieses Projekt initiiert. Das XX-Gen steht unter der Kontrolle entweder des 35S-Promotors aus dem Blumenkohlmosaik-Virus oder eines über Hitze induzierbaren Promotors.