12.12.2008

Forschung Projekte

Produktion eines Bt-Toxin-Standards und Entwicklung eines Messverfahrens zur Erfassung der Menge des Toxins in Bt-Mais

(2001 – 2004) Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum (DLR) Rheinpfalz, Neustadt/Weinstraße

Thema

Für den Verbund der Sicherheitsforschungsprojekte zu Mais wurde zentral

• standardisiertes Bt-Toxin hergestellt
• eine einheitliche Messmethode entwickelt und etabliert, mit der die jeweilige Menge des in den Maispflanzen gebildeten Bt-Toxins erfasst werden kann.

Die zentrale Produktion von Bt-Toxin (Cry1Ab) gewährleistet, dass alle Partner des Verbundprojektes mit dem gleichen Toxinstandard arbeiten. So wird sichergestellt, dass die Ergebnisse der Teilprojekte vergleichbar sind und dass bei eventuell auftretenden Unterschieden in den Auswirkungen auf Nicht-Zielorganismen verschiedene Bt-Toxin-Varianten als Ursache ausgeschlossen werden können.

Einheitliche, standardisierte Verfahren zur Messung des jeweiligen Toxingehaltes sind eine Voraussetzung, um die innerhalb einzelner Teilversuche und für verschiedene Pflanzenteile ermittelten Werte vergleichen zu können. Dazu wurden Methoden zum quantitativen Nachweis von Bt-Toxin entwickelt. (ELISA)

Zusammenfassung

Insgesamt wurden von 2001 bis 2003 den Projektpartnern 635 Milligramm Bt-Toxin und 122 Milligramm Bt-Protoxin zur Verfügung gestellt. Das Toxin war stabil lagerungsfähig und wurde auf seine biologische Aktivität kontrolliert.

Bei Mon810 war die Bt-Toxin-Expression in den Wurzeln während der gesamten Vegetationsperiode annähernd konstant. In Stängeln und Blättern stieg das Toxin im Laufe der Vegetationsperiode an. In den Blättern war der Toxin-Gehalt am höchsten, in den Kolben am geringsten.

Bei der Maislinie Bt176 war die Expression von Cry1Ab-Toxin in Wurzeln, Stängeln und Kolben sehr gering. In den Blättern wurde das Toxin in den späteren Entwicklungsstadien gegenüber den früheren Stadien stärker exprimiert.

Die Toxingehalte schwanken sowohl saisonal als auch zwischen den Pflanzenteilen. Die gemessenen Toxingehalte unterschieden sich z. T. erheblich von jenen, die aus entsprechenden Versuchen in den Vereinigten Staaten bekannt sind, konnten aber in der Tendenz bestätigt werden. Dieser Befund unterstreicht die Bedeutung dieser Untersuchungen unter hiesigen klimatischen Bedingungen und mit hiesigen Sorten.

Versuchsbeschreibung

Produktion Bt-Toxin

Das Bt-Toxin wurde mit einer international anerkannten Methode in E.coli produziert. Das Toxin ist vergleichbar mit den in den transgenen Pflanzen produzierten Toxinen, auch wenn die Vorstufen nicht identisch sind. Nach Aktivierung im Mitteldarm der Insekten bleibt von dem hier produzierten Toxin und von dem Toxin in den Bt-Pflanzen der gleiche gegenüber dem Verdauungs-Enzym Trypsin unempfindliche, Insekten-aktive „Proteinkern“ übrig.

Die produzierte Vorstufe des Bt-Toxins, Protoxin genannt, wurde mit Trypsin behandelt und zu verwendungsfertigem Bt-Toxin weiter aufgereinigt. Für einen größeren Maßstab wurden die dazu nötigen Verfahrensschritte optimiert.

Mit mehreren Tests wurde die Einhaltung gleich bleibender Qualitätsstandards für das Bt-Toxin kontrolliert:

• Biochemischer Nachweis der Äquivalenz (Gleichwertigkeit) zwischen in E.coli und in den transgenen Pflanzen hergestelltem Bt-Toxin (z.B. Vergleich der Molekulargewichte und Tests auf Antikörper-Reaktionen)
• Biologische Wirkungskontrolle: Bestimmung der akuten Toxizität des standardisierten Bt-Toxins im Vergleich mit anderen Varianten des Toxins in Bezug auf den Maiszünsler. Die biologische Aktivität von Protoxin und Toxin wurde in Bioassays mit den Larven des Maiszünslers überprüft.

Messstandard Bt-Toxin

Während der Vegetationsperiode wurden von beiden Standorten vier mal Pflanzenproben von Wurzeln, Blatt, Stängel, Pollen und Kolben entnommen und mittels einer immunologischen Methode (ELISA) deren Bt-Toxin-Gehalt bestimmt. Parallel wurde gefriergetrocknetes Toxin untersucht.

Untersuchung von Stabilität und Lagerfähigkeit von Cry1Ab

Biochemische Stabilität. Nach Abschluss des Projektes werden weiterhin auch Stabilität und Lagerfähigkeit des Toxins bei minus zwanzig und minus achtzig Grad Celsius untersucht. Teile der gelagerten Toxine wurden halbjährlich biochemisch untersucht.

Bioassay. Als Parameter für die biologische Aktivität wurden Bioassays durchgeführt. Dabei wurden unterschiedliche Toxinkonzentrationen auf die Oberfläche der Nahrungsquelle frisch geschlüpfter Maiszünslerlarven gegeben. Die Bioassays wurden nach sieben bzw. 14 Tagen ausgewertet und in Abständen von ca. drei bis zehn Monaten wiederholt, um einen möglichen Einfluss der Lagerbedingungen auf die Toxinstabilität zu erfassen.

Ergebnisse

Produktion Bt-Toxin

Die Produktion von Bt-Toxin wurde mit einem transformierten E. coli Stamm durchgeführt. Das Bt-Toxin wurde isoliert und gereinigt. Die Überprüfung der Größe und Reinheit des hergestellten Toxins erfolgte durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese. Protoxin und Toxin waren bei minus zwanzig Grad Celsius Lagerung für mindestens acht Monate stabil.

Insgesamt wurden von 2001 bis 2003 den Projektpartnern 635 Milligramm Bt-Toxin und 122 Milligramm Bt-Protoxin zur Verfügung gestellt.

Biologische Wirkungskontrolle: Der LC50-Wert - Toxinkonzentration, bei der 50 Prozent der Versuchstiere sterben - lag bei fünfzig bzw. 72 Nanogramm pro Quadratzentimeter bei der Oberflächen-Applikation. Diese verschiedenen Konzentrationen waren auf unterschiedliche Reinheitsgrade der Chargen zurückzuführen. Die Aktivität des Protoxins blieb über einen Zeitraum von vier bis sechs Lagerungswochen bei vier Grad Celsius stabil.

Biotests unter Verwendung von getrocknetem transgenen Maispulver (MON810) zeigten trotz niedriger Mortalität der Maiszünslerlarven eine vollständige Wachstumshemmung des Maiszünslers bei 0,45 Mikrogramm pro Milliliter Medium.

Messstandard Bt-Toxin

Von 2001 bis 2003 wurden die Toxingehalte in verschiedenen Pflanzenteilen der transgenen Linien Mon810 und Bt176 im Verlauf der Vegetationsperiode bestimmt. Insgesamt wurden 2023 Gewebeproben entnommen und deren Bt-Toxin-Gehalt bestimmt.

Die Toxingehalte der transgenen Maisproben wurden mit einer ELISA-Methode quantifiziert. In ca. neun Prozent der gesamten Pflanzenproben konnte in allen Geweben kein Toxin nachgewiesen werden. Diese Pflanzen wurden bei der statistischen Auswertung nicht berücksichtigt.

Bt-Toxin-Gehalt in Mon810

Bei der Betrachtung der Expression des Bt-Toxins in den vier Entwicklungsstadien während der gesamten Vegetationsperiode zeigte sich folgendes Bild: Die Expression in den Wurzeln war annähernd konstant. In Stängeln und Blättern zeigte sich hingegen, dass das Toxin im Laufe der Vegetationsperiode anstieg. In den Blättern war der Toxin-Gehalt am höchsten, in den Kolben am geringsten. Im Vergleich zwischen den Versuchsjahren zeigte sich, dass in der Tendenz der Gehalt des Toxins im Jahr 2002 geringer war als in den Jahren 2001 und 2003.

Die Werte des Bt-Toxins wiesen an den beiden Standorten ähnliche Muster innerhalb der verschiedenen Pflanzenteile auf. Allerdings lagen die Toxinmengen an dem einen Standort in fast allen Entwicklungsstadien während der drei Versuchsjahre ungefähr sechs bis 49 Prozent über denen des anderen Standorts.

Bt-Toxin-Gehalt in Bt176

Bei der Maislinie Bt176 konnte Cry1Ab-Toxin in 32 Prozent der Wurzelproben nicht nachgewiesen werden. In den oberen Blättern waren die Toxingehalte in den späteren Stadien deutlich höher als in den früheren Stadien. Ähnlich wie bei Mon810 zeigte sich auch hier ein deutlicher Unterschied zwischen den Bt-Toxin-Gehalten in den Jahren 2001 und 2003 und dem Jahr 2002.

Untersuchung von Stabilität und Lagerfähigkeit von Cry1Ab

Stabilität. Das Toxin blieb über einen Zeitraum von 18 bis 22 Monaten hinweg bei minus zwanzig Grad und minus achtzig Grad biochemisch stabil.

Bioassay. Es stellte sich heraus, dass die Aktivität des Cry1Ab-Toxins, das bei minus zwanzig Grad gelagert wurde, innerhalb von ein bis dreißig Monaten um das ein- bis zu 200-fache abnahm. Die Aktivität des Toxins in einer Charge nahm sehr stark ab, so dass keine LD50 mehr erreicht wurde. Die stärkste Abnahme wurde nach zehn bzw. 18 Monaten Lagerung beobachtet.

Bei minus achtzig Grad blieb dagegen die Bioaktivität des Toxins deutlich stabiler als bei minus zwanzig Grad.

Gefriergetrocknetes Cry1AB zeigte keine signifikanten Unterschiede der LC50-Werte zwischen ein und zwölf Monaten.