14.10.2005

Forschung Projekte

Eliminierung überflüssiger Gensequenzen bei Zuckerrübe

(2001 – 2004) KWS / PLANTA Angewandte Pflanzengenetik und Biotechnologie GmbH, Einbeck

Thema

Im Rahmen dieses Projektes wurden zwei neue Systeme daraufhin untersucht, ob sie sich dazu eignen, aus transformierten Zuckerrüben überflüssige Gensequenzen, vor allem nicht mehr benötigte Markergeneschnell, effektiv und möglichst in einem Schritt zu entfernen.

Ac/Ds-Transposon-System. Bisher gab es keine Erfahrungen bei der Anwendung von Transposon-Systemen bei Zuckerrübe. Deshalb wurde zunächst die Funktionalität dieses Systems in Zuckerrüben geprüft.

Informationen zum Verfahren:

Cre/Lox-Rekombinationssystem unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors. Der Vorteil dieses Systems liegt in der automatischen Eliminierung des Markergens während der Samenproduktion. Die folgende Generation sollte damit Markergen-frei sein.

Informationen zum Verfahren:

Zusammenfassung

Grundsätzlich funktionieren beide Systeme. Bis sie praktisch eingesetzt werden können, sind jedoch noch einige Probleme zu lösen. Das Ac/Ds-Transposon-System funktioniert in der Zuckerrübe. Offen ist derzeit noch, wie häufig diese „Gensprünge“ sind und wie weit die Entfernungen zwischen dem alten und neuen Integrationsort im Genom sind.

Die Entfernung des Markergens mit dem Cre/Lox-System wurde in Tabak- und Zuckerrübenpflanzen mit einem Promotor erreicht. Ein weiterer Promotor erwies sich als ungeeignet.

Versuchsbeschreibung

Das Projekt besteht aus mehreren Schritten und Untersuchungen.

Ac/Ds-Transposon-System

  • Erstellung von Vektorkonstrukten, in die das Ac/Ds-Transpositionssystem integriert ist.
  • Test auf Funktionalität mit Hilfe von Reportergenen, die eine erfolgreiche Neupositionierung der Gene (= Transposition) anzeigen.
  • Verbesserung der Effizienz der Transformation von Zuckerrüben; dazu sollen verschiedene Promotoren getestet werden.
  • Stabile Transformation in Zuckerrüben
  • Analyse des Effekts des Transposons durch molekulare Analysen

Cre/Lox-System

  • Erstellung von Vektorkonstrukten mit dem Cre/Lox-Rekombinasesystem
  • Transformation von Ackerschmalwand (Arabidopsis), Tabak oder Raps, um verschiedene Promotoren zu überprüfen; danach Transformation von Zuckerrübe
  • Testung verschiedener Promotoren, die nur im Samen bzw. Embryo reagieren (Samen/Embryospezifität)
  • Molekulare Charakterisierung der Transformanten über PCR

Ergebnisse

Grundsätzlich funktionieren beide Systeme. Bis sie praktisch eingesetzt werden können, sind jedoch noch einige Probleme zu lösen.

Das Ac/Ds-Transposon-System funktioniert in der Zuckerrübe. Es konnte sowohl das „Herausspringen“ des Markergens als auch seine Reintegration an anderer Stelle im Genom der Zuckerrübe erstmals nachgewiesen werden.

Es wurden auch Nachkommen der transgenen Zuckerrüben erzeugt.

Eine offene Frage bleibt, wie häufig diese durch das AC/DS-System bewirkten „Gensprünge“ sind und wie weit die Entfernungen zwischen dem alten und neuen Integrationsort im Genom sind.

Zwei Tabaksprosse. Der obere Spross ist mit dem Markergen- Eliminierungssystem (samenspezifischer Promotor) transformiert. Wunsch-Gen ist hierbei ein Gen für ein grün fluoreszierendes Protein, (GFP), das jedoch nur aktiv sein kann, wenn das Markergen entfernt wird. Der untere Spross dient als nicht-transgene Kontrolle .

Unter UV-Licht leuchtet nur der obere Spross, da hier durch die erfolgte Markergen- Eliminierung das GFP (Green Fluorescense Protein) aktiviert wurde

Mit dem Cre/Lox-System wurden vierzig unabhängige Tabak-Transformanten erzeugt. Nach Analyse der nächsten Generation (F1) zeigte sich, dass die verwendeten samenspezifischen Promotoren unterschiedlich gut funktionierten:

  • Während bei Verwendung eines bestimmten Promotors nur wenige Pflanzen Markergen-frei waren, hatten alle Nachkommen der Tabakpflanzen mit einem anderen Promotor das Markergen wieder verloren. Bei ihnen war das angestrebte Ziel erreicht.
  • Dass diese Pflanzen tatsächlich transgen waren, konnte über den Fluoreszenzeffekt des gfp-Reportergens eindeutig nachgewiesen werden.Diese Fluoreszenz tritt nur auf, wenn die Pflanzen Markergen-frei sind.

Bei Tabakpflanzen konnten nach zwei Generationen vollkommen Markergen-freie Pflanzen gefunden werden.

Dieses Ergebnis konnte inzwischen bei Zuckerrüben bestätigt werden. Molekulare Analysen belegen die Markergenfreiheit.