Die Strukturanalyse von Pilzgemeinschaften im Rahmen des anbaubegleitenden Monitoring.

(2001 – 2004) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) (seit 2008 Julius Kühn-Institut (JKI)), Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit

Thema

Bodenmikroorganismen sind von großer Bedeutung für Bodenqualität und funktionierende Stoffkreisläufe im Agrarökosystem. Im Rahmen eines anbaubegleitenden Monitorings gentechnisch veränderter Pflanzen ist geplant, mikrobielle Gemeinschaften im Boden zu untersuchen, um eventuelle Verschiebungen frühzeitig zu entdecken.

Um Grundlagen für die Bewertung möglicher Effekte transgener Pflanzen auf die Gemeinschaft der Bodenmikroorganismen zu haben, sollte die natürliche Variabilität pilzlicher Gemeinschaften erfasst werden, hier am Beispiel von Pilzgemeinschaften im Wurzelraum von Zuckerrüben.

Insbesondere galt es zu analysieren, wie stark der Einfluss wechselnder Umweltbedingungen und ackerbaulicher Maßnahmen ist, um dann in einem weiteren Schritt Abweichungen - möglicherweise verursacht durch gentechnisch veränderte Pflanzen - ermitteln zu können.

Molekulare Methoden zur Charakterisierung von Pilzgemeinschaften sollten weiterentwickelt werden, um sie in einem anbaubegleitenden Monitoring einsetzen zu können.

Es hat sich gezeigt, dass molekularbiologische Methoden zur Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften besser geeignet sind als traditionelle Kultivierungsmethoden, da sie weniger arbeitsaufwändig und aussagekräftiger sind. Über traditionelle Kultivierungstechniken werden schätzungsweise nur ein bis zehn Prozent der in der Rhizosphäre lebenden Bakterien erfasst.Der Anteil kultivierbarer Pilze ist zurzeit noch nicht bekannt.

Zusammenfassung

Die entwickelten Methoden eignen sich zum Nachweis von Verschiebungen in der Struktur von Pilzgemeinschaften aus Boden und Rhizosphäre. Ein deutlicher Einfluss der Bodenart auf die Gemeinschaftsstruktur der Pilze und eine Abhängigkeit der Gemeinschaftsstruktur von der Pflanze wurden nachgewiesen, ebenso wie die saisonal bedingte Verschiebung der Pilzgemeinschaften im Boden in Abhängigkeit von dem Probenzeitpunkt bzw. Wachstumsstadium der Zuckerrübe.

Ein Einfluss der Sorte auf die Bodengemeinschaft der Pilze konnte nicht nachgewiesen werden. Die angewendeten Strategien eignen sich für ein freisetzungsbegleitendes Monitoring, nicht jedoch für ein anbaubegleitendes Monitoring. Nur die gleichzeitige Kultivierung von gentechnisch veränderten Pflanzen, isogenen Linien und konventionellen Sorten auf dem gleichen Feld können relevante Daten liefern.

Versuchsbeschreibung

Zwischen der Pflanzenwelt und der mikrobiellen Gemeinschaft im Boden besteht eine starke Wechselbeziehung. Pflanzen geben über ihre Wurzeln eine Vielzahl von organischen Substanzen ab, die auf die Mikroorganismen im wurzelnahen Raum fördernde und/oder hemmende Wirkungen zeigen. Die Beeinflussung von mikrobiellen Gemeinschaften durch die Pflanze wird als Rhizosphäreneffekt bezeichnet.

Die Zusammensetzung der von der Pflanze abgegebenen Stoffe kann bei transgenen Pflanzen gegenüber nicht transgenen Pflanzen abweichen; so können beispielsweise auch gezielt Transgen-Produkte in den Wurzelraum abgegeben werden, um mikrobielle Krankheitserreger im Wurzelbereich zu bekämpfen.

Die Untersuchungen fanden im Wurzelraum konventioneller Zuckerrüben statt, da eine Freisetzung herbizidtoleranter Zuckerrüben nicht wie ursprünglich geplant erfolgen konnte. Im Rahmen der Sortenprüfung wurde der Einfluss der Sorte und des Standorts auf die Zusammensetzung und Häufigkeit der Arten der pilzlichen Gemeinschaft bestimmt.

Folgende Arbeitsziele standen im Vordergrund:

Probenahme und Aufarbeiten von Bodenproben

Erarbeitung praktikabler Lösungen hinsichtlich der Probenahme und Aufarbeitung von Bodenproben zur Pilzanalyse bei großen Probenumfängen.

Optimierung molekulargenetischer Methoden

Zur Charakterisierung der Pilzgemeinschaft in Boden- und Rhizoshärenproben sollten verschiedene Fingerprinting-Methoden getestet und weiterentwickelt werden. Insbesondere galt es, geeignete Methoden für Serienuntersuchungen zu erarbeiten, die reproduzierbare Ergebnisse liefern.

Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft im Agrarökosystem

Das Projekt sollte Aussagen zu folgender Frage liefern: Was ist die „normale“ Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft im Agrarökosystem und außerhalb welcher Toleranzgrenzen kann eine Abweichung als Warnsignal für mögliche nachteilige Wirkungen gentechnisch veränderter Pflanzen auf die Pilzgemeinschaft interpretiert werden? Dies setzte voraus, dass entsprechend im Vorfeld die natürliche Schwankungsbreite, verursacht durch Umwelteinflüsse oder ackerbauliche Maßnahmen, bestimmt wurde. Bisher gibt es nur wenige Untersuchungen zu dieser „baseline“-Bestimmung.

Das vorliegende Projekt ist vernetzt mit dem Querschnittsverbund „Methoden zur Untersuchung von Mikrobengemeinschaften für ein anbaubegleitendes Monitoring von gentechnisch veränderten Pflanzen“(2001-2006).

Ergebnisse

Probenahme und Aufarbeitung von Bodenproben

Als geeignetste Methode zum Aufschluss von pilzlichen Zellwänden hat sich der mechanische Aufschluss erwiesen. Zur Aufarbeitung von DNA aus schwierigen Proben wurde außerdem ein PCR-Verfahren entwickelt, das eine Vervielfältigung großer DNA-Fragmente ermöglicht (semi-nested PCR). Dieses Verfahren wurde zur Gewinnung von pilzlichen Fingerprints (DGGE-denaturing gradient gel electrophoresis) von Bodenproben aus 36 verschiedenen Dauerbeobachtungsstandorten verwendet.

Weiterhin wurden die etablierten molekularen Methoden zur Strukturanalyse von Pilzgemeinschaften an mehreren Standorten mit unterschiedlichen Bodenarten und mit fünf verschiedenen Zuckerrübensorten genutzt.

Optimierung molekulargenetischer Methoden

Zur Bestimmung der Diversität der Pilzgemeinschaften bot sich die Analyse der 18S-rDNA (kleine Untereinheit der pilzlichen Ribosomen) an. Diese Gensequenzen sind in Pilzen allgemein verbreitet. Zur Beurteilung der Aussagekraft der PCR-DGGE-Fingerprinting-Methode wurden eine Klonbibliothek und eine Sammlung von Pilz-Isolaten angelegt. Die elektrophoretische Mobilität der 18S-Fragmente von Pilz-Klonen bzw. -Isolaten wurde mit DGGE-Fingerprints der Pilzgemeinschaften aus Boden verglichen. Die meisten Banden der Klone bzw. Isolate konnten Banden der DGGE-Fingerprints der untersuchten Pilzgemeinschaften zugeordnet werden.

Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft im Agrarökosystem

Im Verlauf der Vegetationsperiode 2002 wurden vier Boden- und zwei Rhizosphären-Probenahmen durchgeführt. DNA wurde aus dem Boden bzw. den Wurzeln extrahiert. Der Vergleich der DGGE-Muster der 18S rDNA-Fragmente zeigte dabei einen erheblichen Einfluss des Standorts auf die Zusammensetzung der Pilzgemeinschaften im Boden.

Die Auswertung der DGGE-Muster zeigte eine starke Abhängigkeit der Zusammensetzung der pilzlichen Gemeinschaft von der Bodenart.

Ein Einfluss der Zuckerrüben-Sorte auf die Struktur der Pilzgemeinschaften konnte nicht nachgewiesen werden.