Untersuchungen zu extrachromosomaler Fremd-DNA in transgenen Pflanzen

(1992 – 1995) Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft (BBA) (seit 2008 Julius Kühn-Institut (JKI)), Institut für Pflanzenvirologie, Mikrobiologie und biologische Sicherheit, Braunschweig; TU Braunschweig, Botanisches Institut

Thema

Es ist möglich, dass die zur Transformation von Pflanzen eingeführte Fremd-DNA nicht vollständig in das Genom integriert wird (extrachromosomale DNA). Unter bestimmten Voraussetzungen könnten diese Fremdgene von in der Pflanzenzelle vorhandene Bakterien aufgenommen werden. Dieser Vorgang könnte zu einer weiteren Verbreitung der Fremdgene beitragen.

Das Forschungsprojekt beschäftigte sich mit folgenden Fragen:

  • Überleben zur Transformation verwendete Agrobakterien in den transgenen Pflanzen (= Persistenz)? Wenn ja, wo und in welchem Umfang? Ist dies vermeidbar?
  • Kann bei der Pflanzentransformation Fremd-DNA auch in Endophyten gelangen? (Endophyten sind bestimmte, in Pflanzen lebende Bakterien.)
  • Tritt extrachromosomale Fremd-DNA auch in transgenen Getreidepflanzen (Gerste) auf? Welche Rolle spielt dabei die verwendete Transformationsmethode?

Zusammenfassung

Persistenz von Agrobakterien

Die zur Pflanzentransformation eingesetzten Agrobakterien können über längere Zeit in transgenen Pflanzen überleben. Sie können aber nachgewiesen und eliminiert werden.

Transformation von Endophyten

Unter künstlichen Bedingungen (Elektroporation) können Endophyten mit den für Pflanzen vorgesehenen Vektoren transformiert werden. In den Pflanzen selber weist nichts auf einen Gentransfer in die Endophyten hin.

Gerste

In Gerste wurde keine extrachromosomale Fremd-DNA gefunden. Die Stabilität der neu eingeführten Gene hängt von der Transformationsmethode ab. Die höchste Effizienz und Reproduzierbarkeit wird derzeit mit der Partikelkanone erzielt.

Versuchsbeschreibung

Persistenz von Agrobakterien

Neben Tabak wurden auch transgene Zuckerrüben-, Raps-, Kartoffelpflanzen sowie Ackerschmalwand (Arabidopsis) auf die Persistenz von Agrobakterien getestet. Die Agrobakterien wurden aus den Pflanzen isoliert und vermehrt. Mit verschiedenen immunologischen und molekularen Methoden konnte herausgefunden werden, ob es sich um die zur Transformation eingesetzten Agrobakterien handelte. Die Agrobakterien wurden durch Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie in den Tabakpflanzen lokalisiert.

Um zu überprüfen, ob Agrobakterien auf Samen übertragen werden können, wurden transgene Tabakpflanzen, in denen Agrobakterien vorhanden waren, im Gewächshaus zur Blüte gebracht. Die daraus hervorgegangenen Keimlinge wurden auf Agrobakterien hin untersucht.

Transformation von Endophyten

Ein Endophyt (Sphingomonas paucimobilis) wurde isoliert und unter künstlichen Bedingungen (Elektroporation) mit einem Pflanzentransformationsvektor transformiert.

Zudem wurde versucht, den Endophyten in der Pflanze mittels direktem Gentransfer zu transformieren. Dabei wurde die Partikelkanone als Transformationsmethode eingesetzt.

Der Endophyt wurde durch Einführung eines Reporter-Gen (Luciferase-Gens) markiert und auf Gerste übertragen.

Gerste

Gerste wurde mit verschiedenen Verfahren transformiert: sowohl in Protoplasten und mit der Partikelkanone, als auch über Makroinjektion in unreife Ähren und Pollenschlauch- Transformation. Die transgenen Pflanzen sowie deren Nachkommen wurden auf Expression der Fremdgene und auf die Anwesenheit extrachromosomaler Fremd-DNA untersucht.

Ergebnisse

Persistenz von Agrobakterien

Auch zwei Jahre nach der Transformation waren in vielen transgenen Pflanzen noch die für die Transformation verwendeten Agrobakterien vorhanden. Das Fremdgen war nicht mehr in allen Fällen intakt. Die isolierten Agrobakterien konnten aber erneut zur Pflanzentransformation genutzt werden.

Persistierende Agrobakterien wurden in Raps-, Kartoffel-, Ackerschmalwand und Tabakpflanzen gefunden, jedoch nicht in Zuckerrüben. Die Agrobakterien waren in den jungen, im Labor kultivierten Pflanzen gleichmäßig verteilt. In Erde „wanderten“ die Agrobakterien aus den oberirdischen Teilen (Blatt, Sprossachse) in die Wurzeln, ihrem natürlichen Lebensraum. Zur Blüte waren keine Agrobakterien mehr in den oberirdischen Teilen der Tabakpflanzen nachweisbar.

Agrobakterien werden nicht durch Tabaksamen in die nächste Generation weitergegeben.

Die Persistenz der Agrobakterien konnte durch Einsatz von Antibiotika reduziert werden. Auch die Meristemkultur, die auf der Annahme beruht, dass an der Sprossspitze Agrobakterien-freies Gewebe vorliegt, war zur Eliminierung geeignet.

Transformation von Endophyten

Es gelang erstmals, einen Endophyten unter artifiziellen Bedingungen mit einem Pflanzen- transformationsvektor stabil zu transformieren. Die transgenen Endophyten konnten mindestens zwölf Monate in den Pflanzen überdauern.

Eine direkte Transformation des Endophyten in der Pflanze war nicht möglich.

Der Endophyt breitet sich in der Gerstenpflanze aus, persistiert dort und ist samenübertragbar. Das Fremdgen wurde aber nicht vom Endophyten auf Gerstenzellen übertragen.

Gerste

Protoplasten / Partikelkanone: Das eingeführte Fremdgen wurde stabil und mit hoher Aktivität exprimiert. Gerstensequenzen in den Vektoren fördern die Stabilität. Es gab keine Anzeichen für extrachromosomale Fremd-DNA.

Makroinjektion / Pollenschlauch-Transformation: Nur 0,1% der behandelten Pflanzen erhielten das Fremdgen. Von den Nachkommen dieser transgenen Pflanzen enthielten nur noch 2% die Fremdgene, die aber starke Strukturumbauten aufwiesen. Häufig auftretende auffällige Veränderungen wie z.B. ein Steckenbleiben von Ähren traten auch bei Kontrollen auf, die ohne DNA injiziert wurden.

Es wurde keine extrachromosomale DNA gefunden.