04.06.2003

Forschung Projekte

Erhöhung der Effektivität von Rhizobienstämmen für den Einsatz in der Landwirtschaft

(1996 – 1998) Universität Bielefeld, Fakultät für Biologie, Lehrstuhl für Genetik

Thema

Bestimmte Knöllchenbakterien (Rhizobium meliloti) leben in Symbiose mit Luzerne. Sie fixieren den Stickstoff aus der Luft und wandeln ihn in eine für die Pflanzen verwertbare Form um.

Es gibt Mutanten von Rhizobium meliloti, die sich durch erhöhte symbiontische Effekte mit Luzerne auszeichnen. An diesen Mutanten sollte untersucht werden,

• ob die Verbesserung der Symbioseeigenschaften einzelnen Genen zugeordnet werden kann,
• ob sich der Einsatz dieser Gene in gezielten Mutanten lohnt. Dies sollte zunächst im Mikrokosmos (geschlossener Behälter mit Boden) und später im Freiland untersucht werden.

Für die Anwendung in der Praxis sollten entsprechende Mutanten auch ohne Antibiotikaresistenz-Gene als Marker hergestellt werden.

Zusammenfassung

Es wurden sieben R. meliloti-Mutanten mit erhöhter symbiontischer Effektivität mit Luzerne identifiziert, von denen eine näher untersucht wurde. In dieser wurden drei neue Gene identifiziert und molekular charakterisiert, die alle die Effektivität der Symbiose mit Luzerne erhöhen.

Neue Mutanten mit den drei Genen zeigten in Mikrokosmos-Experimenten eine erhöhte symbiotische Effektivität.

Versuchsbeschreibung und Ergebnisse

Analyse der Mutanten

Es wurden verschiedene R. meliloti-Mutanten auf ihre Symbioseeigenschaften mit Luzerne hin untersucht. Dabei wurden sieben Transposon-Mutanten mit erhöhter symbiontischer Effektivität gefunden.

Von diesen wurden die betroffenen Genregionen isoliert und die Nukleotidsequenz im Bereich des Insertionsortes bestimmt. Diese lagen sowohl auf dem Chromosom als auch auf dem Mega-Plasmid 1 und 2.

Genetische und physiologische Analyse der Genregion eff-482

Aus einer Mutante (T482), bei der das Transposon in das Megaplasmid 1 integriert war, wurde eine Genregion (eff-482) isoliert, kloniert und sequenziert. Es wurden drei Gene identifiziert, die alle die Effektivität der Symbiose mit Luzerne beeinflussen. Ein Gen kodiert für eine Endoglucanase, ein weiteres für eine Adenylatcyclase. Das dritte Genprodukt stellt einen negativen Regulator für das zweite und dritte Gen dar.

Mikrokosmosanalysen mit Mutanten der Genregion eff-482

In die drei identifizierten Gene wurden Markergene eingebaut. Diese Mutanten wurden in Mikrokosmos-Versuchen untersucht.

Alle Mutanten bewirkten in Symbiose mit Luzerne eine deutliche Erhöhung der symbiotischen Effektivität. Das zeigte sich an einer Steigerung des Pflanzentrockengewichtes um ca. 15 Prozent im Vergleich zum Ausgangsstamm. Daher eignen sich diese Mutanten für den Einsatz in der Landwirtschaft.

Freilandversuche

Eine Mutante (T482) wurde in drei Luzerne-Anbauregionen Russlands unter Freilandbedingungen getestet. In mindestens einer Region wurde eine deutliche Ertragsteigerung erzielt.

Konstruktion von Antibiotikaresistenz-Gen-freien Mutanten

Die Mutanten tragen alle Antibiotikaresistenz-Gene. Sie wurden als Ausgangsstämme zur Erzeugung von Deletionsmutanten, die das Antibiotikaresistenz-Gen nicht mehr enthalten, genutzt.