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deutschOptimierung der CRISPR-Cas-Effizienz in Rabl-konfigurierten Getreide-Genomen
Koordinator: Frau Dr. Corina Vlot-Schuster – ()
Projektbeschreibung
Gen Editierung mittels CRISPR-Cas macht weiter wo die klassische Genetik aufhört. Nun können mechanistische Studien auch in Organismen mit schwer zugänglichen Genomen, wie zum Beispiel Gerste und Weizen, durchgeführt werden. Das Ziel des CrisBar Projektes ist die Etablierung von hoch Durchsatz Methoden für die Auswahl von Zielsequenzen, das Design von effizienten sowie hoch-spezifische gRNAs und dessen Screening auf Mutageneseeffizienz und mögliche Phänotypen, die mit der pflanzliche Immunität zusammenhängen. CrisBar spezialisiert sich dabei auf Gerste und vor allem Weizen.
CrisBar nutzt rezent etablierte bioinformatische Resourcen für die Auswahl einer nicht zuvor realisierbaren Anzahl von mehr als 1000 CRISPR-Cas Ziel Sequenzen und deren assoziierten gRNAs in Gerste und Weizen. Die Ziel Sequenzen werden entlang die sogenannte Rabl Struktur der Getreide Chromosomen gewählt umso den Effekt von der Platzierung von Zielsequenzen für die CRISPR-Cas Mutageneseeffizienz festzustellen. Darüber hinaus werden Zielsequenzen in verschiedenen genomischen und Sequenz Hintergründen gewählt und in Weizen vor Allem auch getestet auf deren subgenomischen Spezifizität. CRISPR-Cas Mutationsraten werden in Protoplasten, die mit Reporter- und CRISPR-Cas Vektoren transformiert werden, bestimmt. Klonierung von Ziel Sequenzen und gRNAs in den entsprechenden Vektoren sowie das auf Fluoreszenz basierte Screening der CRISPR-Cas Mutageneseeffizienz sollen in der automatisierten hoch Durchsatz konfokale Mikroskopie Anlage SignalSCREEN etabliert werden. Weitere bioinformatische Ansätze werden verwendet um Anforderungen für die Auswahl von Zielsequenzen sowie die Sequenz von effizienten und hoch-spezifischen gRNAs zu bestimmen. Darüber hinaus soll in SignalSCREEN eine Phänotypisierung von Merkmalen der pflanzlichen Immunität in CRISPR-Cas mutagenisierten Protoplasten etabliert werden, die die Auswahl von Ziel Sequenzen, die mit relevanten Phänotypen assoziiert sind, deutlich erleichtern soll. Damit erweitert dieses Projekt die Anwendungen der im Rahmen des BMBF-geförderten Deutschen Pflanzen Phänotypisierungs Netzwerks etablierte SignalSCREEN Platform auf CRISPR/Cas-relatierte Anwendungen in Protoplasten. Die Kombination von CRISPR-Cas Mutagenese und Phänotypisierung von Stress-relatierte Merkmalen in Protoplasten könnte die Notwendigkeit Pflanzen stabil zu mutieren verringern und somit Züchtungsprozessen unterstützen.
CrisBar
Enhancing CRISPR-Cas efficiency in Rabl-configured cereal crop genomes
Coordinator: Frau Dr. Corina Vlot-Schuster – (Institut)
Project description
Gene-editing applications based on clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in combination with CRISPR-associated nucleases (Cas) are of enormous importance in basic and applied science. CRISPR-Cas-mediated genome editing opens up possibilities to undertake directed editing, even in organisms that have been resilient to classical approaches. This allows mechanistic studies of genes in e.g. barley (Hordeum vulgare) and wheat (Triticum aestivum). CrisBar aims to optimize the selection of both target genes and corresponding CRISPR-Cas guide RNAs. We will establish high throughput pipelines for target gene selection and gRNA design and screening for convenient and high-efficiency multiplex genome editing in monocotyledonous plants, in particular barley and wheat. Both cereal crops were two of the first domesticated food crops and wheat has been the basic staple food of the major civilizations of Europe, West Asia and North Africa. Today, wheat is grown on more land area than any other commercial crop and continues to be the most important food grain source for humans. We will exploit the recent and game-changing availability of complete reference genomes for barley and hexaploid wheat to systematically analyse chromosomal as well as genomic prerequisites for CRISPR-Cas targets and gRNAs. Both barley and wheat genomes display distinct chromosomal territories that are associated with the so-called Rabl configuration in cereal genomes, a particular chromosomal conformation that organises the chromosomes in fold-back structures with telomeres at one pole of the nucleus and the centromeres of all chromosomes aligned at the opposing pole. This particular configuration aligns with functional characteristics of the different territories of the chromosomes and is expected to influence CRISPR-Cas targeting efficiency. We will combine optimized gRNA design with experimental tools to further enhance the throughput of CRISPR-Cas reporter systems, allowing us to deduce gRNA design rules from an unprecedented minimum of ~1100 target-gRNA combinations, focusing on both specificity and multi-plexing between homeologous gene copies among the subgenomes of wheat. Finally, this project will capitalize on DPPN (German Plant Phenotyping Network; BMBF) phenotyping facilities and establish a high throughput screen for plant immunity-related traits of target-gRNA combinations in elicitor-treated protoplasts. Together, this project will result in experimental and bioinformatic toolkits to optimize (1) gene and gRNA selection based on the chromosomal context of the target genes, (2) mutagenesis efficiency, and (3) the detection of defense-associated phenotypes in cereal crops.
Teilprojekte
Laufzeit 01.07.2018 – 30.06.2020