CRISPR/Cas ist kein Gen zu klein

Peptidhormone sind wichtige Wachstumsregulatoren. Von vielen dieser Hormone ist die genaue Funktion bisher unbekannt. Eine neue, offene Mutantenkollektion ermöglicht es jetzt, die Funktion von CLE-Peptiden einfacher zu bestimmen.

In mehrzelligen Organismen kommunizieren die Zellen über Signalmoleküle miteinander. So koordinieren sie beispielsweise das Wachstum und andere wichtige Entwicklungsprozesse. Von vielen Signalmolekülen sind die Funktionen bisher jedoch unbekannt. So auch von den CLE-Peptiden, kurz für CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION. Diese Peptide regulieren zum Beispiel die Differenzierung von Stammzellen in unterschiedlichen Geweben. Aber wie genau?

Wissenschaftler haben jetzt eine neue Ressource erzeugt, die bei der Beantwortung dieser Fragen helfen kann. Mit Hilfe von CRISPR/Cas9 gelang es ihnen, Knockout-Mutanten von Arabidopsis thaliana herzustellen, bei denen eines oder gleich mehrere der 32 CLE-Gene defekt sind. Diese Pflanzen können somit die betroffenen CLE-Peptide nicht mehr herstellen.

Gene-Knockout dank CRISPR

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„Unsere genetische Sammlung hat das Potenzial, unbekannte Peptidhormone wie das CLE44 zu untersuchen“, sagt Assistenzprofessor Takashi Ishida von der Kumamoto Universität. Sein Team nutze CRISPR/Cas9 dafür, in den CLE-Genen Doppelstrangbrüche zu erzeugen. Bei der Reparatur dieser Schäden bauten die Zellen versehentlich eine, selten auch mehrere, Base zu viel oder zu wenig ein – das Gen verlor dadurch seine Funktion.

„Diese Arbeit liefert wichtiges Material für zukünftige Forschung“, sagt Professor Thomas Laux von der Universität Freiburg, der ebenfalls an CLE-Peptiden forscht.

Kleine Gene werden selten zufällig verändert

CLE-Gene sind nur wenige hundert Basenpaare lang und damit sehr klein. Herkömmliche Methoden zur Erzeugung von Knockout-Mutanten wie zum Beispiel ionisierende Strahlung oder T-DNA tagging, waren deshalb selten erfolgreich. Denn dabei entstehen Mutationen ganz zufällig an irgendwelchen Orten im Genom. Erst mit CRISPR/Cas lässt sich genau steuern, wo die Mutation stattfinden soll.

Um die Effizienz ihrer Methode zu testen, untersuchten die Forscher zunächst das bisher am besten untersuchte CLE-Peptid CLV3. Es ist bereits bekannt, dass CLV3 die Zellteilung von Stammzellen im Vegetationskegel der Sprossachse hemmt. Wie erwartet, produzierte die CLV3-Mutante unregelmäßig geformte Früchte, da das Gewebe ohne Steuerung durch CLV3 unkontrolliert wucherte. Die Knockout-Mutanten funktionierten also.

Doppel- und Trippelmutanten nötig

Als nächstes analysierten die Forscher den Phänotyp der CLE44-Mutante. Von diesem Peptid war bisher keine Funktion beschrieben. Weil seine Sequenz aber große Ähnlichkeit mit CLE41 aufweist, vermutete man ähnliche Funktionen der beiden Signalmoleküle.

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CLE41, das war bereits bekannt, reguliert die Zellzahl in den Leitbündeln, den Versorgungsbahnen in Pflanzen für Wasser und gelöste Nährstoffe. Ist dies auch die Funktion von CLE44? Ja, denn genau das ließ sich mit der CLE44-Mutante bestätigen. Bei der CLE41-CLE44-Doppelmutante war der Phänotyp - eine Reduktion der Zahl von vaskulären Bündelzellen im Kambium - noch stärker ausgeprägt.

„Da viele CLE-Peptide wahrscheinlich redundante Funktionen haben, werden sicher noch weitere Mehrfachmutanten nötig sein“, erklärt Laux. Zukünftig sollen mit Hilfe der Mutantenkollektion noch weitere bisher unbekannte Funktionen von CLE-Peptiden entschlüsselt werden. Da nach wie vor die Funktion der meisten Gene jeglicher Lebewesen im Verborgenen liegt, helfen Methoden wie die der punktgenauen Genomeditierung mehr Licht ins Dunkel, also die Funktion zu den Genen, zu bringen.

Neben der Grundlagenforschung werden auch anwendungsnahe Forschungsdisziplinen wie die Pflanzenzüchtung von diesen Methoden profitieren. Signalpeptide sind Schalter für komplexe Eigenschaften. Diese gezielt zu verändern erlaubt es, wie am Beispiel der vorliegenden Studie gezeigt wurde, die innere Architektur von Pflanzen zu verändern und damit ihre Möglichkeiten, Wasser und Nährstoffe zu transportieren. Eigenschaften also, die maßgeblich Einfluss auf Wachstum und Entwicklung haben.