Single-Molecule Real-Time Sequencing

Exakte Genomsequenz von trockenresistentem Gras bestimmt

18.11.2015 | von Redaktion Pflanzenforschung.de

Prof. Dr. Dorothea Bartels mit dem Gras Oropetium thomaeum in der Anzuchtkammer des Instituts für Molekulare Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen an der Universität Bonn. (Bildquelle: © Barbara Frommann/Uni Bonn)
Prof. Dr. Dorothea Bartels mit dem Gras Oropetium thomaeum in der Anzuchtkammer des Instituts für Molekulare Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen an der Universität Bonn. (Bildquelle: © Barbara Frommann/Uni Bonn)

Heutzutage gelten viele pflanzliche Genome als sequenziert. Die Qualität der Sequenzen lässt allerdings wegen der Komplexität pflanzlicher Genome oft zu wünschen übrig. Wissenschaftler haben nun das Genom eines extrem dürreresistenten Grases sequenziert – und das dank der Single-Molecule Real-Time-Methode mit sehr hoher Genauigkeit.

Nachrichten von neu sequenzierten Genomen sind schon lange alltäglich geworden. Bis heute sind etwa 100 pflanzliche Genome sequenziert - darunter finden sich auch die allermeisten genetischen Codes unserer wichtigsten Nahrungspflanzen. Und doch erregt die Bekanntgabe der Genomsequenz eines auf den ersten Blick völlig unbedeutenden Grases aus Indien Aufsehen. Oropetium thomaeum heißt die kleinwüchsige Pflanze, die ein wahrer Überlebenskünstler ist. Ihre Besonderheit: „Diese Gras-Spezies kann bis zu 95 Prozent ihres Wassergehaltes verlieren und bleibt trotzdem überlebensfähig“, so Prof. Dr. Dorothea Bartels vom Institut für Molekulare Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen an der Universität Bonn.

Damit hat sich Oropetium thomaeum optimal an ausgeprägte Dürreperioden angepasst – eine Fähigkeit, die in Anbetracht des Klimawandels in ferner Zukunft auch für unsere Nahrungspflanzen und die Futterpflanzen in der Viehwirtschaft vorteilhaft sein könnte.

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Trockenheit kann dem aus Indien stammenden Gras Oropetium thomaeum nichts anhaben.

Trockenheit kann dem aus Indien stammenden Gras Oropetium thomaeum nichts anhaben.

Quelle: © Patrick Cebulla / pixelio.de

Auf die Qualität kommt es an

Aufsehen erregte die Genomsequenz wegen ihrer besonders guten Qualität. Diese hängt bei einer pflanzlichen Genomsequenz von verschiedenen Faktoren ab: der Genomgröße, der Ploidie, der Heterzygosität und der Sequenzabdeckung. Wenn die Basenabfolge der vielen kleinen Sequenzabschnitte bestimmt ist, müssen die sogenannten Contigs am Ende in die richtige Reihenfolge gebracht werden - eine Aufgabe, die gerade bei komplexen Pflanzengenomen mit zahlreichen repetitiven Sequenzen bis heute eine Herausforderung darstellt. Deutsche Forscher zählen seit Jahren auf diesem Gebiet der Genomassemblierung und Annotation zu den Experten weltweit.

Nicht codierende Sequenzabschnitte sind wichtig

Gerade die frühen Sanger- und die gegenwärtig häufig benutzen Next-Generation-Sequenzierungsplattformen arbeiten mit kurzen Contigs, die ein vollständiges, fehlerfreies Zusammensetzen der Genomsequenz gerade in Bereichen mit vielen Wiederholungen erschweren oder unmöglich machen. Das kann fatale Folgen haben. Denn dank intensiver Forschung weiß man heute, dass auch die nicht codierenden Sequenzabschnitte wichtige biologische Funktionen übernehmen. Sie dürfen daher bei der Sequenzierung eines Genoms nicht vernachlässigt werden.

Single-Molecule Real-Time Sequencing

Um das Genom von Oropetium thomaeum zu sequenzieren, benutzen die Forscher eine Methode namens „Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing“, die von der im Silicon Valley ansässigen Firma Pacific Biosciences (PacBio) entwickelt wurde.

SMRT basiert auf einem natürlichen Prozess, der bei jeder Zellteilung stattfindet. Vor jeder Teilung replizieren die DNA-Polymerasen die DNA. Im Zuge der Sequenzierung wird jedes der vier Nukleotide zunächst mit einem fluoreszierenden Phosphat-Farbstoff versehen, der von der DNA-Polymerase beim Einbau des Nukleotids in den komplementären DNA-Strang abgetrennt wird. Das Signal eines jeden neu eingebauten Nukleotids wird erfasst und korrespondiert mit der entstehenden DNA-Sequenz. Der große Vorteil dabei: Die DNA-Polymerase kann komplementäre DNA-Stränge über weite Strecken mit großer Genauigkeit anfertigen und das in Echtzeit, also während die DNA-Polymerase den Einzelstrang komplementiert.

Dabei entstehen extra lange Sequenzabschnitte von mehr als 16 Kilobasen, die wenige, zufällige Fehler im Lesemuster enthalten. Die Wissenschaftler setzten 99 Prozent des Oropetium Genoms mit insgesamt 625 Contigs zusammen, von denen jeder etwa 2,4 Megabasen lang war.

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Dieses Video erklärt das Vorgehen bei der Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing-Methode.
(© Pacific Biosciences/youtube.com)

Auch intergenetische Bereiche erfasst

Bei der so entstandenen Genomsequenz spricht man auch von einem nahezu fertigen Entwurf, denn sie enthält eine lückenlose Abdeckung sowohl aller Genbereiche, als auch die Sequenzen zwischen den Genen. Dazu gehören beispielsweise Zentromere, Telomere, Transposons und rRNA Cluster, die in gewöhnlichen Sequenzentwürfen nicht berücksichtigt sind. Genomsequenzen in ähnlich guter Qualität gibt es bisher nur für Reis, Hirse oder der Zwenke (Brachypodium), einer Modelpflanze für Süßgräser, also Getreide. Das trockenresistente Gras Oropetium thomaeum verfügt über 28.466 protein-codierende Gene. 43 Prozent des Genoms sind repetitive Sequenzen. Es ist das kleinste bisher sequenzierte Grasgenom.

Gute Sequenzqualität für vergleichende Genomstudien

Für Wissenschaftler ist die qualitativ hochwertige Genomsequenz des Grases besonders nützlich: Nur mit einer solchen Genomsequenz sind vergleichende Genomstudien wirklich sinnvoll und machbar. Auf ihrer Grundlage lassen sich beispielsweise neue Gene entdecken und, wie in diesem Fall, nützliche Gene für die extreme Trockenheitstoleranz. Eventuell lassen sich diese auch auf andere Nutzpflanzen übertragen oder sie können helfen, in anderen Arten ähnliche Gene zu finden und zu fördern. „Sequenzen, die bestimmte Schutzstoffe codieren, kommen besonders häufig im Genom von Oropetium thomaeum vor“, so Prof. Bartels. Solche Gensequenzen sind in zahlreichen Pflanzen vertreten – in Oropetium sind sie aber deutlich stärker ausgeprägt. Diese Pflanze verfügt damit in ihrem Erbgut über eine wirkungsvolle Blaupause für schützende Proteine und Kohlenhydrate, die dafür sorgen, dass empfindliche Zellstrukturen des Grases bei starker Austrocknung keinen Schaden nehmen.

Kleinwüchsigkeit unerwünscht in ertragsorientierter Landwirtschaft

Ganz so einfach wird die Übertragung der Dürre-Resistenzgene auf Reis, Mais oder Weizen allerdings nicht funktionieren. Denn Oropetium thomaeum bezahlt seine Trockenheitsresistenz mit seiner Kleinwüchsigkeit – und die ist in der ertragsorientierten Landwirtschaft in dieser extremen Form weniger gefragt. Außerdem sind in dem Graswinzling viele unterschiedliche Gene an der Widerstandskraft gegen Dürre beteiligt. Trotz aller Schwierigkeiten, die in Zukunft beim Übertrag der Trockenresistenz auf andere Pflanzen überwunden werden müssen, haben die Wissenschaftler mit ihrer Arbeit einen entscheidenden Grundstein für weitere Versuche, vor allem aber zum besseren Verständnis der Trockenheitstoleranz gelegt.

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