Was bei der Gentransformation molekular passiert

Genomweite Effekte der T-DNA-Insertion erstmals umfassend analysiert

01.02.2019 | von Redaktion Pflanzenforschung.de

Eine transformierte Ackerschmalwand mit der Darstellung ihrer Genomsequenzierung im Hintergrund. (Bildquelle: © Salk-Institut)
Eine transformierte Ackerschmalwand mit der Darstellung ihrer Genomsequenzierung im Hintergrund. (Bildquelle: © Salk-Institut)

Wenn fremde DNA in eine Pflanze transformiert wird, verändert das die Ziel-DNA meist auch an ungewollten Stellen – und manchmal mit ungewollten Folgen. Mit neuesten molekularbiologischen Methoden hat ein US-Team unter Beteiligung deutscher Forscher diese Effekte am Beispiel der Ackerschmalwand in zuvor unerreichter Genauigkeit dokumentiert.

Ob in der Forschung oder in der Züchtung: Häufig soll ein fremdes Gen in eine andere Pflanzen übertragen werden, um dieser eine neue Eigenschaft zu verleihen. Idealerweise wird dabei genau eine funktionale Kopie des Gens an einer definierten Stelle im Erbgut eingefügt. In der Praxis wird dazu häufig das Bakterium Agrobacterium tumefaciens eingesetzt. Doch dieser Ansatz ist manchmal weit entfernt vom Idealfall. Dies zeigt eine aktuelle Studie aus den USA, an der deutsche Forscher beteiligt waren.

Gentransfer eines Bakteriums gekapert

Seit Jahrzehnten ist bekannt, dass Agrobacterium Bäume infiziert und Teile seiner DNA in das Genom der Pflanze transferiert. Dazu erzeugt es Doppelstrangbrüche in den Wirtszellen und lässt seine DNA vom Reparaturmechanismus des Wirts an diesen Stellen einbauen. Forscher haben jene Teile des bakteriellen Erbguts entfernt, die für die Pflanze schädlich sind, und nutzen die Transfer-DNA (T-DNA) des Bakteriums heute, um gezielt neue Gene in eine Pflanze zu übertragen.

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Joseph Ecker, Florian Jupe, Todd Michael, Mark Zander and Angeline Rivkin (v. li.) haben untersucht, was auf molekularer Ebene geschieht, wenn ein neues Gen in eine Pflanze transformiert wird.

Joseph Ecker, Florian Jupe, Todd Michael, Mark Zander and Angeline Rivkin (v. li.) haben untersucht, was auf molekularer Ebene geschieht, wenn ein neues Gen in eine Pflanze transformiert wird.

Quelle: © Salk Institute

Inzwischen deuten Analysen jedoch darauf hin, dass diese Methode strukturelle und chemische Eigenschaften der pflanzlichen DNA verändern kann. Viele transformierte Pflanzen enthalten nur unvollständige oder verkettete T-DNA-Fragmente, deren zugehörige Gene dann nicht aktiv sind.

Bisherige Ansätze waren jedoch limitiert und ermöglichten keine vollständige Analyse. Sie haben Schwierigkeiten, wenn eine DNA-Sequenz viele Wiederholungen aufweist. „Die größte Unbekannte war bislang, ob gemeinsam mit der beabsichtigten Gensequenz Kopien der T-DNA eingefügt worden sind – und wenn ja, wie viele“, erläutert Florian Jupe, einer der Erstautoren der Studie.

Das Forschungsteam hat deshalb zwei noch junge Methoden kombiniert, um auch die längeren Abschnitte in hoher Auflösung analysieren zu können: die optischer Kartierung (Bionano Genomics Irys System; BNG) und die Nanopore-Sequenzierung (Oxford Nanopore Technologies MinION; ONT). Sie untersuchten vier Linien der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), die durch Transformation erzeugt worden sind und keine sichtbaren phänotypischen Nebenwirkungen der T-DNA-Insertion zeigen.

Optische Genomkartierung und Nanopore-Sequenzierung

Die optische Genomkarte ergab für jede der vier Linien bis zu vier strukturelle Veränderungen in der Größe von 27 bis 236 kb. Angesichts der Größe des Transformationsvektors übertrafen diese Veränderungen in ihrer Dimension die Erwartungen um das 20- bis 60-fache. Außerdem fanden die Biologen in den Linien zwischen ein und sieben Genomveränderungen, darunter allein in einer Linie drei Insertionen, eine Inversion sowie der Austausch von zwei Chromosomen-Enden.

Dank der Nanopore-Sequenzierung konnten die Forscher ganze Chromosomen-Arme in einem Stück analysieren und selbst ein Viertel aller beim Referenzgenom der Ackerschmalwand nicht in die richtige Reihenfolge zu bringenden Abschnitte korrekt zusammensetzen. Insgesamt konnte die Methode 98 Prozent des Referenzgenoms abbilden. Die zwei Prozent, die sich bei der Referenz nicht zuordnen ließen, waren Sequenzierungsfragmente mit hoch repetitiven Sequenzen. Die Sequenzierungsergebnisse bestätigten die optischen Ergebnisse auf die Base genau. Sie zeigten auch die Vielfalt der eingefügten DNA-Fragmente, die mal zerstückelt, mal invertiert und mal stumm waren.

Aufgrund der Auflösung konnten die Forscher in einigen Fällen Vermutungen anstellen, welche genetischen Konstellationen für die Effekte ursächlich waren. Dabei fanden sie heraus, weshalb das Transgen bei einer Linie stumm ist, bei einer anderen hingegen aktiv: Offenbar traten die für das Stummschalten verantwortlichen siRNAs mit der Länge von 24 Basenpaaren in nur einer Linie auf und hemmten den Promotor.

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Quelle: © Jörg Abendroth / MPl für Entwicklungsbiologie

Veränderte Histonstrukturen

In einem dritten Schritt untersuchten die Forscher mittels ChIP-seq den Einfluss auf die Histone, welche die DNA in bestimmte Strukturen packen und so epigenetische Effekte bewirken. In der Nähe der T-DNA-Insertionen fanden sich Veränderungen, darunter eine zuvor noch nicht als Transformationseffekt beschriebene Dreifach-Methylierung der Aminosäure H3K27 und der Einbau des Histones H2A.Z in das Empfängergenom. „Das ist der erste hochaufgelöste Einblick, wie T-DNA-Insertionen die lokalen epigenetischen Bedingungen formen können“, betont Mark Zander vom Salk-Institut, weiterer Erstautor der Studie.

„Vor einem Jahr wäre diese Studie noch nicht möglich gewesen“, erklärt Todd Michael vom JCV-Institut, ebenfalls Erstautor. Die Nanopore-Sequenzierung habe das Ablesen der komplexesten Regionen des Genoms revolutioniert, die zuvor unzugänglich und daher unbekannt waren. Die vierte Erstautorin Angeline Rivkin vom Salk-Institut ergänzt: „Diese Technologie ist so aufregend, weil sie uns einen viel klareren Blick dafür gibt, was in einigen dieser transgenen Arabidopsis-Linien vor sich geht.“

Großes Potenzial für die Pflanzenzüchtung

Weitere Experimente sollen nun zeigen, welche Rolle der sogenannte Floral Dip hat, mit dem die Transformation vollzogen wird, ob die Schnitte und Neuanordnungen der DNA bei der Insertion und der späteren meiotischen Teilung erfolgen, und welche Mechanismen die Verkettung der T-DNA-Stränge bewirken.

Obwohl die vorliegende Arbeit aufgrund des kleinen Genoms der Ackerschmalwand einfacher war, als sie es für wichtige Nutzpflanzen mit größeren Genomen wäre, sehen die Forscher in diesen den nächsten Schritt. „Heutige Methoden erfordern es, Hunderte transgene Linien zu screenen, um die leistungsstarken zu finden, also beispielsweise jene ohne zusätzliche Insertionen. Diese neue Technologie könnte einen viel effizienteren Ansatz bieten“, hofft Joseph Ecker, der Leiter der Studie.

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