CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease)
CUT&RUN ist eine moderne molekularbiologische Methode zur Analyse von DNA-Protein-Interaktionen, insbesondere zur Untersuchung von Histonmodifikationen und der Bindung von Transkriptionsfaktoren an spezifische DNA-Sequenzen. Die Methode zeichnet sich durch ihre hohe Sensitivität, geringe Hintergrundsignale und geringe Anforderungen an die Ausgangsmenge biologischen Materials aus, was sie zu einer beliebten Alternative zur klassischen Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) macht.
Der zentrale Ablauf von CUT&RUN beginnt mit der Bindung eines Antikörpers an das Zielprotein, das untersucht werden soll, beispielsweise ein spezifisch modifiziertes Histon. Die Zellen oder Zellkerne werden dabei auf einer festen Oberfläche immobilisiert, um die Strukturen intakt zu halten. Anschließend wird eine Protein-A-G-Mikrokonjugation eingesetzt, um den Antikörper zu binden, der mit einem Nuklease-Enzym (meistens MNase, Micrococcal Nuclease) fusioniert ist.
Nach der Bindung wird die Nuklease aktiviert und schneidet spezifisch DNA-Fragmente in der unmittelbaren Umgebung des Zielproteins. Diese Fragmente, die die Bindungsstellen des Proteins repräsentieren, werden in Lösung freigesetzt und können anschließend durch einfache Verfahren gesammelt werden. Der letzte Schritt umfasst die Isolierung und Sequenzierung dieser DNA-Fragmente, um die Bindungsorte des Zielproteins oder der Histonmodifikationen im Genom zu bestimmen.
CUT&RUN wird häufig verwendet, um das Verteilungsmuster von Histonmodifikationen, wie beispielsweise H3K4me3 (assoziiert mit aktiven Promotoren) oder H3K27me3 (assoziiert mit repressiven Chromatinregionen), zu analysieren. Dies bietet wertvolle Einblicke in epigenetische Mechanismen, die Genexpression, Chromatinstruktur und zelluläre Identität regulieren.
Die Methode überzeugt durch ihre geringe Hintergrundstörung, da ungebundenes Chromatin und unspezifische DNA größtenteils entfernt werden, bevor die DNA-Fragmente analysiert werden. Zudem erfordert CUT&RUN im Vergleich zu ChIP eine signifikant geringere Anzahl von Zellen, was sie besonders für Anwendungen mit begrenztem Probenmaterial, wie Primärzellen oder klinischen Proben, geeignet macht.