iCLIP

iCLIP (individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation) ist eine molekularbiologische Methode, mit der sich die Bindungsstellen von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) auf einzelne Nukleotide genau bestimmen lassen. Sie wird eingesetzt, um zu verstehen, wie Proteine die Verarbeitung von RNA steuern – zum Beispiel beim Spleißen, bei der Stabilität oder beim Transport von mRNAs.

Das Verfahren basiert auf einer Kombination aus UV-Bestrahlung, die Protein-RNA-Komplexe in lebenden Zellen kovalent vernetzt, und anschließender Immunpräzipitation, bei der das Zielprotein zusammen mit den gebundenen RNA-Stücken isoliert wird. Nach enzymatischer Fragmentierung und Markierung der RNA-Fragmente werden diese durch Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben und sequenziert. Ein charakteristisches Merkmal von iCLIP ist, dass die Reverse Transkription häufig an der Vernetzungsstelle abbricht. Dadurch lässt sich die exakte Bindungsposition des Proteins auf der RNA mit einzelnukleotidgenauer Auflösung rekonstruieren.

iCLIP hat sich als besonders leistungsfähiges Werkzeug etabliert, um die RNA-Zielsequenzen von Splicing-Faktoren, regulatorischen Proteinen oder RNA-bindenden Enzymen umfassend zu kartieren und deren Funktion im Zellkontext zu verstehen.