CROPS OF THE FUTURE

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Entwicklung eines DNA-freien Genom-Editing Systems in Pappel nach transienter Übertragung eines Cas9/gRNA-Plasmids und Ribonukleinproteins in Protoplasten und keimenden Pollen

Koordinator: PD Dr. Matthias Fladung – Johann Heinrich von Thünen-Institut Bundesforschungsinstitut für Ländliche Räume, Wald und Fischerei

Projektbeschreibung

Ziele - Die schnell wachsende Weltbevölkerung und der rasch voranschreitende Klimawandel sind bedeutende Herausforderungen für die Zukunft. Neben der Sicherstellung ausreichender Mengen an qualitativ hochwertigen Lebensmitteln müssen auch genügende Mengen an nachwachsenden Rohstoffressourcen erzeugt werden, z.B. Holz, das aus Bäumen gewonnen wird, die entweder in Wäldern oder in Kurzumtriebsplantagen kultiviert wurden. Der Satz an neuartigen Züchtungstechniken, insbesondere CRISPR/Cas9, bietet die Möglichkeit, die Züchtung von Bäumen signifikant zu beschleunigen. Dieses Projekt zielt in einem methodischen Ansatz darauf ab, zwei verschiedene CRISPR/Cas9-Systeme in Pappeln zu testen, die zu nicht-transgenen genom-editierten Pflanzen führen.

Arbeitsplan - Zwei verschiedene CRISPR/Cas9-Systeme werden in Pappeln getestet: (i) Plasmid, das Cas9-Gen und guideRNA (gRNA) enthält und (ii) DNA-freier Cas9/gRNA-Ribonuklein-Proteinkomplex. Das PDS-Gen ist nicht von kommerziellem Interesse, jedoch dient es in diesem zwei Jahre laufenden „Proof-of-Concept“-Projekt als leicht nachweisbares Markergen für eine erfolgreiche PDS-Gen-Editierung. Im Erfolgsfall kann das PDS-Gen gegen ein beliebiges kommerziell interessantes Gen ausgetauscht werden.

Beide Systeme, die gRNA für das PHYTOENE DESATURASE (PDS)-Gen enthalten, werden transient sowohl auf Pappelprotoplasten als auch auf keimenden Pollen übertragen. CRISPR/Cas9-behandelte Protoplasten werden bis zum Kallusstadium kultiviert. Erhaltene Kalli werden auf editierte Bereiche im PDS-Kandidatengen hin untersucht und Pflanzen werden regeneriert.

Keimender Pollen, der mit beiden Komplexen (CRISPR/Cas9-Plasmid-DNA und Ribonukleinprotein) behandelt wurde, wird verwendet, um weibliche Pappel zu bestäuben. Wir können Kreuzungen an 6-8 Monate alten Pappel durchführen. F1-Keimlinge werden auf editierte Bereiche im PDS-Gen hin untersucht, und nach 6-8 Monaten werden erneut eine Blüte induziert und Kreuzungen durchgeführt. F2-Keimlinge werden auf homozygot editierte Bereiche im PDS-Gen hin untersucht. Pflanzen, die mit dieser Technologie hergestellt werden, gelten in Bezug auf die europäische Gesetzgebung immer noch als transgen. In diesem Projektvorschlag wird die Technologie der frühen Blüte nur zur Prüfung des „Proof-of-Concept“-Ansatzes verwendet und in einer möglichen praktischen Anwendung nicht berücksichtigt.

Erwartete Ergebnisse - Die Anwendung beider Systeme wird Pappelpflanzen erzeugen, die keine fremden DNA-Sequenzen tragen, sondern nur eine Mutation im ausgewählten Kandidatengen aufweisen. Im Gegensatz zum
Protoplastenansatz, der bevorzugt bei der Pappel und nur in Klonen mit ausreichend entwickelten Protoplastenregenerationssystemen anwendbar ist, könnte der transiente Pollenansatz leicht auf jede Baumpflanzenart übertragen werden. Dieses System wird als „Proof-of-Concept“ in Pappeln getestet.

(english (Beta))

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Development of a DNA-free genome editing system in poplar by transient Cas9/gRNA plasmid and ribonucleinprotein transfer into protoplasts and germinating pollen

Projektbeschreibung (en)

Aims - Fast growing world global population and rapid progressing climate change are significant challenges for the future. Besides ensuring sufficient amounts of high-quality food, also adequate amounts of renewable material resources have to be produced, e.g. wood, harvested from trees either grown in forests or in short rotation coppices. The new set of novel breeding techniques, in particular CRISPR/Cas9, offers the opportunity to significantly accelerate tree breeding. This project aimed to methodically test two different kinds of CRISPR/Cas9 systems in poplar leading to non-transgenic genome edited plants.

Work plan – Two different kinds of CRISPR/Cas9 systems will be tested in poplar: (i) plasmid containing Cas9 gene and guideRNA (gRNA) and (ii) DNA-free Cas9/gRNA ribonucleinprotein complex. Both systems containing gRNA for PHYTOENE DESATURASE (PDS) gene will transiently be transferred to both poplar protoplasts and germinating pollen. CRISPR/Cas9-treated protoplasts will be cultivated until the callus stage. Obtained calli will be screened for edited sites in the PDS candidate gene, and plants will be regenerated. Germinating pollen treated with both complexes (CRISPR/Cas9 plasmid DNA and ribonucleinprotein) will be used to pollinate female poplar. We are able to perform crossings in 6-8 month-old poplar. F1 seedlings will be screened for edited sites in the PDS gene, and after 6-8 months again flowering will be induced and crosses done. F2-seedlings will be screened for homozygous edited sites in the PDS gene.

Expected results – The application of both systems will create poplar plants that don’t carry any foreign DNA sequences but only reveal a mutation in the selected candidate gene. Unlike the protoplast approach which will only be applicable in clones with sufficiently developed protoplast regeneration systems, the transient pollen approach could easily be transferred to any tree plant species. This system will be tested as proof-of-concept in poplar.

Eckdaten

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Projektlaufzeit

01.06.2018 - 31.05.2020

Förderkennzeichen

031B0535

Fördersumme

Öffentlich: 395.661,00 €
Privat: 0,00 €
Gesamt: 395.661,00 €
Herr PD Dr. Matthias Fladung
E-Mail-Kontakt
Johann Heinrich von Thünen-Institut
Bundesforschungsinstitut für Ländliche Räume, Wald und Fischerei

Sieker Landstr. 2
22927 Großhansdorf
Deutschland
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