CROPS OF THE FUTURE

TraGEApple

Etablierung einer transienten Methode zum CRISPR/Cas9 basierten Genom Editing an Apfel

Koordinator: Dr. Henryk Flachowsky – Julius Kühn-Institut Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen (JKI)

Projektbeschreibung

Der Apfel gehört zu den ökonomisch bedeutendsten Obstarten weltweit. Klimatische Veränderungen und das Auftreten neuer Schaderreger erfordern stetig die Züchtung neuer und besser adaptierter Sorten. Dies ist jedoch ein langwieriger Prozess, der eine zeitnahe Reaktion auf aktuell existierende Probleme nicht ermöglicht. Mit modernen CRISPR/Cas9-basierten Genom Editing Verfahren sollte es jedoch möglich sein, am Markt etablierte Sorten in einem überschaubaren Zeitraum in einzelnen Merkmalen (z.B. durch gezielte Mutagenese oder Integration/Austausch ganzer Gene) zu verbessern. Der allgemeine Ansatz einer stabilen Integration des CRISPR/Cas9-Systems und dessen anschließende Auskreuzung, wie es bei vielen selbstbefruchtenden Arten angewendet wird, ist für Genom Editing bei Apfel nicht zielführend. Der Apfel ist ein Fremdbefruchter. Sein Genom ist deshalb stark heterozygot. Eine nachträgliche Entfernung von stabil integrierten CRISPR/Cas9-Sequenzen durch sexuelle Auskreuzung führt folglich durch Rekombinationen zu neuen Genotypen und damit zu einem Verlust der sortentypischen Eigenschaften. Deshalb ist die Entwicklung einer transienten CRISPR/Cas9-Technologie für Genom Editing Anwendungen bei Apfel unerlässlich.

Der Focus des Projekts liegt in der Etablierung eines transienten CRISPR/Cas9-basierten Systems für Genom Editing bei Apfel, als eine neue und effiziente Methode für gezielte Züchtung, die ebenfalls für andere vegetativ vermehrte Kulturarten angewendet werden kann. Es werden verschiedene Methoden für die transiente Expression des CRISPR/Cas9-Systems etabliert und optimiert, wie zum Beispiel die Transfektion mithilfe Zell-penetrierender Peptide, Agrobakterium-vermittelte und biolistische Transformation. Die effizienteste dieser Methoden soll anschließend in zwei Proof-of-Concept-Experimenten angewandt werden. Im ersten Experiment soll ein Knockout eines endogenen Apfelgens durchgeführt werden, das als Reporter für eine erfolgreiche, zielgerichtete Mutagenese fungiert. Das zweite Experiment zielt auf einen Allel-Austausch einer endogenen Sequenz ab. In beiden Proof-of-Concept Experimenten werden erfolgreiche Genome Editing Ereignisse durch eine Farbänderung des Gewebes detektiert. Genom-editierte Pflanzen werden regeneriert und die Zielsequenzen (On-Target sites) werden auf molekulargenetischer Ebene im Detail untersucht. Weiterhin werden mögliche Off-Target Loci identifiziert und analysiert. Im Erfolgsfall wird eine Genom Editing Technologie für Apfel entwickelt, die für die gezielte Induktion von Mutationen eingesetzt werden kann, sowie auch für die Integration von gewünschten Merkmalen (z. B. Resistenzgene) die durch längere DNA-Abschnitte von genetisch entfernten, aber kreuzbaren Genotypen (z. B. Wildarten) vermittelt werden.

(english (Beta))

TraGEApple
Establishing a transient technology for CRISPR/Cas9-based genome editing in apple

Projektbeschreibung (en)

Apple is one of the economically most important fruit crops worldwide. Continuous changes in climate and the occurrence of new pathogens/races require permanent breeding of better adapted cultivars. However, classical breeding is a long lasting process, which does not allow the prompt reaction on actually existing problems. The use of CRISPR/Cas9-based genome editing technologies offer the opportunity for improving well established cultivars in selected traits (e.g. by targeted mutagenesis or integration/exchange of genes) in an appropriate time frame. A stable integration of DNA sequences coding for the CRISPR/Cas9 system as usually done in many self-pollinating species is disadvantageous for genome editing applications in apple. Apple is cross-pollinated and self-incompatible leading to a pronounced heterozgosity. The removal of stable integrated CRISPR/Cas9 sequences after genome editing by out-crossing would inevitably lead to new genotypes and a loss of the cultivar-specific features. Therefore, the development of transient CRISPR/Cas9 technologies is mandatory for genome editing applications in apple.

The project focuses on the establishment of a transient CRISPR/Cas9-based system for genome editing in apple as a new and highly efficient method for targeted breeding, which also can be used subsequently for breeding of other vegetatively propagated crops. Different methods like cell penetrating peptide (CPP)-mediated transfection, Agrobacterium-mediated or biolistic transformation will be established and optimized for the transient expression of a CRISPR/Cas9 system. The most efficient protocol will then be used in two proof-of-concept CRISPR/Cas9 experiments. The first experiment focuses on a site-directed Knock-out of an endogenous apple gene, which can be used as reporter for successful targeted mutagenesis. The second experiment focuses on the targeted allele exchange of an endogenous sequence. In both proof-of-concept CRISPR/Cas9 experiments, successful genome editing events will be detected by reporter change of tissue coloration. Genome edited plants will be regenerated and on-target sites will be evaluated at the molecular genetics level in more detail. Furthermore, possible off-targets will be identified and analyzed. In the case of success a genome editing technology will be applied to apple which can be used for targeted mutation induction, but also for integration of desired traits (e.g. resistance genes) encoded by longer stretches of DNA from genetically distant, but sexual crossable genotypes (e.g. wild relatives).

Eckdaten

CROPS OF THE FUTURE

TraGEApple

Projektlaufzeit

01.07.2018 - 30.06.2020

Förderkennzeichen

031B0532

Fördersumme

Öffentlich: 216.568,00 €
Privat: 0,00 €
Gesamt: 216.568,00 €
Herr Dr. Henryk Flachowsky
E-Mail-Kontakt
Julius Kühn-Institut (JKI)
Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen

Erwin-Baur-Str. 27
06484 Quedlinburg
Deutschland
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