CROPS OF THE FUTURE

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Gerichtete Genom-Editierung in Kartoffelprotoplasten mittels Laser-basierter Optoporation von CRISPR/Cas9-Nukleoproteinen

Koordinator: Dr. Dag Heinemann – Laser Zentrum Hannover e.V.

Projektbeschreibung

Die Genom-Editierung mittels gezielt designter Nukleasen – Enzyme mit der Fähigkeit Nukleinsäuren gezielt zu schneiden – hat die Möglichkeiten im Bereich der Pflanzenzüchtung revolutioniert. Ein immer noch bestehendes Grundproblem dieser Technologie ist allerdings der effiziente und sichere Transfer dieser molekularen Werkzeuge in die Pflanzenzellen. Laser-basierte Verfahren können hier eine Alternative mit zahlreichen Vorteilen darstellen. Das vorgestellte Projekt befasst sich daher mit dem Einsatz eines innovativen Laser-basierten Optoporationsverfahrens für den Transport von CRISPR/Cas9 Ribonukleoprotein-Komplexen (bestehend aus einer Nuklease und einer Sequenzspezifität-vermittelnden RNA) durch Permeabilisierung der Zellmembran von zellwandlosen Kartoffelprotoplasten. Dieser Ansatz erlaubt die Genom-Editierung von unterschiedlichen Bereichen in der DNA einzelner Protoplasten und somit das systematische Screening von Genotypen von individuellen Abkömmlingen. Das Laser-basierte Verfahren bietet hierbei ein unübertroffenes Sicherheitsprofil für den Genom-Editierungsprozess. Aufgrund der berührungsfreien und rein physikalischen Permeabilisierung der Protoplasten, wird das Risiko toxischer Nebeneffekte z.B. durch verwendete Chemikalien drastisch reduziert. Zudem kann komplett auf das Einbringen transgener DNA (z.B. T-DNA, virale Replikons) verzichtet werden, was einen deutlichen Vorteil in Hinblick auf die regulatorischen Aspekte solcher Pflanzen bietet. Im Rahmen des Projektes werden robuste Protokolle für die Herstellung von Kartoffelprotoplasten, die Laser-basierte Genom-Editierung der Protoplasten sowie für die anschließende Regeneration von vollständigen Pflanzen aus den Protoplasten etabliert.

Das Projekt wird in Form einer Kooperation zwischen der Abteilung Industrielle und Biomedizinische Optik des Laser Zentrum Hannover e.V. (LZH) und dem Institut für Pflanzengenetik der Leibniz Universität Hannover durchgeführt, wobei die Projektpartner die jeweilige Expertise aus ihrem Fachgebiet einbringen. Das Institut für Pflanzengenetik wird hierbei die Konzipierung und Synthese der CRISPR/Cas9 Komplexe, Gewinnung der Protoplasten, Screening der Genotypen und Regeneration der Kartoffelpflanzen umsetzen. Die Optimierung der Parameter für die Optoporation der Protoplastenmembran erfolgt durch das LZH. Hierbei werden die Überlebensraten der Protoplasten sowie die Effizienz, mit der die CRISPR/Cas9

Ribonukleoprotein-Komplexen in die Zellen eingebracht werden können, als relevante Faktoren untersucht. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse werden für die Miniaturisierung sowie Automatisierung des Laser-basierten Verfahrens Anwendung finden. In der Folge ist damit eine Applikation der eingesetzten Methode auf eine große Anzahl vereinzelter Protoplasten möglich, welche durch die Entwicklung eines technischen Demonstrators auch in den Anwenderlaboren getestet werden soll.

Während der ersten Projektphase, konnten erfolgreich die Protokolle zur Generierung von Kartoffelprotoplasten etabliert und die Regeneration zu vollständigen Pflanzen demonstriert werden. Zu dem liegen nun seitens der Leibniz Universität Hannover Reporterkonstrukte vor, mit denen es möglich ist, eine erfolgreiche Genom-Editierung durch die eingebrachten CRISPR/Cas9 Ribonukleoprotein-Komplexe durch rein visuelle Beobachtungen sichtbar zu machen. Bei den hierfür eingesetzten Reportergenen – kodierend für die Proteine β-Glucuronidase (GUS) bzw. GFP – wurde eine Leseraster-Verschiebung eingefügt, welche die Reportergene inaktiviert. Durch das spezifische Schneiden der Zielsequenzen durch die eingebrachten Genscheren wird diese Verschiebung aufgehoben und das Genprodukt kann wieder synthetisiert werden. So lassen sich erfolgreich editierte Kartoffelzellen einfach durch eine blaue Färbung bzw. grüne Fluoreszenz identifizieren. Des Weiteren konnten auch die Sequenzspezifität-vermittelnden RNAs für die CRISPR/Cas9 Ribonukleoprotein-Komplexe entworfen werden, welche vier Gene im Glycoalkaloid-Biosyntheseweg von Kartoffelpflanzen binden, so dass ein Ausschalten dieser erfolgt und bestimmte giftige Inhaltsstoffe (Solanin) von den Pflanzen nicht mehr gebildet werden können.

Durch das LZH konnte parallel die Wirkung der Laser-basierten Technik auf die Protoplasten erfolgen und eine Beeinflussung der Vitalität mit einem Resazurin-Test ermittelt werden. Dieser Test misst das Reduktionspotential und metabolische Aktivität der Protoplasten als Indikator für die Lebensfähigkeit. Da für die Permeabilisierung der Zellmembran bei dieser Technologie Goldnanopartikel als Mediatoren dienen, wurden mehrere Verfahren – z.B. der Einsatz von Linker-Molekülen oder –Proteinen – untersucht, die ein stärkeres Binden der Goldnanopartikel bewirken bzw. eine größere Nähe dieser beiden Komponenten gewährleisten. Als weiterer Schritt im Projekt konnte die Konstruktion und der Aufbau des technischen Demonstrators realisiert werden, so dass im nächsten Schritt ein Transfer der Technologie in das Anwenderlabor erfolgen kann.

(english (Beta))

Targeted gene editing in potato protoplast via optical delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins

Projektbeschreibung (en)

Genome editing via engineered designer nucleases – enzymes that have the ability to specifically cleave nucleic acids – has revolutionized the possibilities for plant breeding. These techniques bring the development of crops with optimized characteristics into target reach. A key remaining obstacle for the success of these applications is the efficient transfer of these molecular tools into plant cells. Laser-based techniques are efficient and safe tools for the delivery of biomolecules to cells. However, they have so far not been explored for genome editing in plant cells. This project aims to develop an innovative laser-based optoporation approach for delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-complexes (consist of a nuclease and a sequence specific guiding RNA) through the permeabilized cell membrane into cell wall deficient potato protoplasts. This process will allow a vector free and DNA free genome editing of different DNA sequences in individual cells facilitating a systematic screening of genotypes from individual offspring.

The laser-based delivery method provides unmatched safety for the genome editing process. Due to the touch-free and physical permeabilization of the protoplasts, the risk of toxic side effects by chemicals can be avoided. In addition, no transgenic DNA (e.g. T-DNA or viral replicons) is introduced into the protoplasts which should alleviate the regulatory aspects of such produced crops.

During this project, robust protocols for potato protoplast generation, their laser-based genome editing, and for the consecutive regeneration of whole plants from protoplasts will be generated.

This project will be conducted as a corporation between the Industrial and Biomedical Optics Department of the Laser Zentrum Hannover e.V. (LZH) and the Institute of Plant Genetics of the Leibniz University Hannover (LUH) as partners. Every partner will bring his expertise from his own field of work. The Institute of Plant Genetics will draft and synthesize the CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-complexes, generate the protoplasts, screen the genotypes and regenerate the potato plants. The parameter optimization for the optoporation of the protoplast’s cell membrane will be carried out by the LZH. The key factors in this analysis will be cell viability and the efficiency with which the CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-complexes enter the cells. The results will be used to automatize and miniaturize the laser-based technique and as a consequence large sample sizes of individual protoplasts can be delivered. A technical demonstrator will be developed, which allows conduction of this technique in end-user laboratories.

During the first project phase, a protocol for the isolation of potato protoplasts was established and the regeneration of whole plants was demonstrated. Furthermore, the Leibniz University Hannover developed reporter constructs which allow detection with the bare eye of successful genome editing by delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-complexes. This technique relies on the use of reporter genes, which are coding for the proteins β-Glucuronidase (GUS) or GFP. Both genes show out-of-reading-frame mutations and have to be cleaved at a specific designed target site by the CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-complexes to produce the operational gen product. These techniques enable one to identify edited potato cells by the blue dye or the green fluorescence. Another step during this phase was accomplished by developing sequence specific mediating single guided RNAs (sgRNA). Each of these sgRNAs bind to one of the four different genes in the glycoalkaloid metabolic pathway of the potato protoplast. Due to this process it is possible to minimalize the concentration of distinct toxic secondary metabolites (solanine) in the plant, because they can no longer be synthesized.

In parallel, the LZH investigated the effect of the laser-based delivery technique on the protoplasts using a resazurin-based assay to quantify the viability. This assay measures the metabolic activity and reduction potential as an indicator for the viability of the protoplasts. Because the GNOME-technology depends on gold nanoparticles to make the cell membrane permeable, several methods were used to increase the binding of the particles to the surface of the protoplasts. One example of such an approach is the use of a binding protein (lectine) and linker molecules. Concurrently with the establishment of the experimental protocols, the design and construction of the technical demonstrator was pursued. This device is going to be used in future lab work.

Eckdaten

CROPS OF THE FUTURE

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Projektlaufzeit

01.06.2018 - 31.05.2020

Förderkennzeichen

031B0542A-B

Fördersumme

Öffentlich: 247.332,00 €
Privat: 0,00 €
Gesamt: 247.332,00 €
Herr Prof. Dr. Jens Boch
E-Mail-Kontakt
Leibniz Universität Hannover

Herrenhäuser Straße 2
30419 Hannover
Deutschland
zur Website
Herr Dr. Dag Heinemann
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Laser Zentrum Hannover e.V.

Hollerithallee 8
30419 Hannover
Deutschland