CROPS OF THE FUTURE

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Neue Technologien für die RNP-vermittelte Genomeditierung in Pflanzen

Koordinator: Prof. Dr. Bernd Müller-Röber – Universität Potsdam

Projektbeschreibung

Die gezielte Insertion von DNS-Sequenzen in das pflanzliche Genom mithilfe moderner Genom-Editierungsmethoden soll untersucht und optimiert werden. Diese Methoden basieren auf RNA-assoziierten Nukleasen (RNPs), die gezielt zu bestimmten DNS-Sequenzen gelotst werden und dort die DNS schneiden. Dieser Doppelstrangbruch (DSB) kann entweder durch einen fehlerbehafteten Reparaturmechanismus entfernt werden, was zu kurzen zufälligen Insertionen oder Deletionen führt, oder durch homologe Rekombination den Einbau eines Reparaturfragments bewirken. Während der fehlerbehaftete Reparaturmechanismus erfolgreich genutzt wird, um z.B. einzelne Gene auszuschalten, ist die gezielte Insertion von DNS-Fragmenten, z.B. zur Regulation der Expression von Genen, derzeit nicht effizient möglich. Das Projekt verfolgt verschiedene Ansätze, mit dem Ziel, die Effizienz des RNA-vermittelten Genom-Editings in Pflanzen zu erhöhen.

Ein spezieller Fokus des Projektes liegt darin, Methoden für das gezielte Knock-in von kurzen, cis-regulatorischen Sequenzen in das Genom zu entwickeln und den Screening-Aufwand, der mit jedem Genom-Editierungsexperiment verbunden ist, zu reduzieren. Im Speziellen sollen folgende Aufgaben adressiert werden: (i) Die Optimierung der Transfektion von RNPs in pflanzliche Protoplasten; (ii) die Applikation von DNA-Reparatur-Fragmenten in räumliche Nähe von durch RNPs induzierten DSBs zur Erhöhung der Knock-in-Frequenzen; (iii) die Evaluation von durch unterschiedlichen Nukleasen herbeigeführten DSBs in Knock-in-Experimenten; und (iv) die Detektion von erfolgreich editierten Zellen bereits auf der Ebene von Protoplasten vor der eigentlichen Kallusbildung oder Pflanzenregeneration. 

In einem Proof of Concept sollen spezifische Insertionen oder Deletionen von cis-regulatorischen Elementen in Promotoren von Zielgenen des Transkriptionsfaktors JUNGBRUNNEN1 (JUB1) herbeigeführt werden. JUB1 wurde in unserem Labor als wichtiger Regulator der Toleranz gegenüber unterschiedlichen abiotischen Stressfaktoren identifiziert, einschließlich Trocken-, Hitze- und Salzstress. Durch Feinregulation der Expression unterschiedlicher JUB1-Zielgene wird es möglich sein, die Stresstoleranz von Pflanzen zu erhöhen, ohne dabei gleichzeitig in Wachstumsprozesse einzugreifen, einem wichtigen züchterischen Ziel.

(english (Beta))

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Enabling technologies for RNP-mediated genome editing

Projektbeschreibung (en)

The aim of the project is to study and optimize the targeted insertion of DNA sequences into the plant genome with the help of genome editing methods. The procedures proposed rely on RNA-protein-complexes (RNPs) which are directed towards defined DNA target sequences to cut the DNA. The double-strand break (DSB) induced by RNP-mediated cleavage can either be removed by an error-prone repair mechanism, which leads to short insertions or deletions, or trigger the insertion of a repair DNA fragment by homologous recombination. While error-prone repair is successfully employed to knock-out distinct genes, the targeted insertion of DNA fragments, e.g. to regulate gene expression, is currently not possible with high efficiency. The project employs different methods for enhancing genome editing efficiency in plants based on RNP delivery.

A special focus of the project lies on methods for targeted knock-in of short cis-regulatory sequences and on reducing the screening effort generally linked to any GE experiment. Specifically, the project addresses the following: (i) optimization of the RNP transfection process; (ii) delivery of DNA repair templates in spatial proximity to RNP-induced double-strand breaks for increased knock-in frequency, (iii) evaluation of double-strand breaks mediated by different nucleases in knock-in experiments, and (iv) single-cell detection of successfully edited cells already at the protoplast level prior to callus formation or plant regeneration.

As a proof of principle, specific insertions or deletions of cis-regulatory elements will be done in the promoters of target genes of the transcription factor JUNGBRUNNEN1 (JUB1) which has been shown by our lab to be an important regulator of the tolerance to various abiotic stresses, including drought, heat and salinity. By fine-tuning the expression of different target genes of JUB1 it will be possible to enhance the tolerance to environmental stresses without compromising growth, which is an important breeding goal.

Eckdaten

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Projektlaufzeit

01.07.2018 - 30.06.2020

Förderkennzeichen

031B0552

Fördersumme

Öffentlich: 499.912,00 €
Privat: 0,00 €
Gesamt: 499.912,00 €
Herr Prof. Dr. Bernd Bernd Müller-Röber
E-Mail-Kontakt
Universität Potsdam
Institut für Biochemie und Biologie

Karl-Liebknecht-Str. 24-25
14476 Potsdam
Deutschland
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