CROPS OF THE FUTURE

GO_CRISPR

Nutzung mobiler CRISPR/Cas9 Transkripte zur Produktion transgen-freier Mutanten in einer Generation durch Pfropfung

Koordinator: Dr. habil. Friedrich Kragler – Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie

Projektbeschreibung

Durch CRISPR/Cas9 können hoch-spezifisch Gene im Erbgut verändert werden. Diese Verfahren erlaubt es gezielt Nutzpflanzen mit höherer Resistenz zu erzeugen. Wir wollen ein CRISPR/Cas9 System etablieren, welche es erlaubt mittels Pfropfung in einer Generation Transgen-freie (GMO freie) Mutanten zu erzeugen.

In unserem Projekt wollen wir die Nutzung des CRISPR/Cas9 Systems in Pflanzen verbessern. Mittels CRISPR/Cas9 können hoch-spezifisch Grenzveränderungen im Erbgut der Pflanzen eingebracht werden. Es kann dazu verwendet werden um neue Eigenschaften wie Krankheits- und Stressresistente Pflanzenlinien zu erzeugen die für die Landwirtschaft äußerst nützlich sind. Ein wesentlicher Nachteil der CRISPR/Cas9 Methode ist es, dass diese Pflanzen Transgene sind und ausgekreuzt werden müssen um sie landwirtschaftlich zu nutzen. In unserem Projekt wollen wir eine neue Methode etablieren die es uns erlaubt in einer Generation stabile und transgen-freie Pflanzenlinien zu etablieren, die aber CRISPR/Cas9 - induzierte genomische Veränderung zeigen. In Pflanzen können bestimmte Makromoleküle wie Proteine oder Ribonukleinsäuren zwischen den Geweben transportiert werden. Wir haben gezeigt, dass eine proteinkodierende Boten-Ribonukleinsäure (Boten-RNS) welche eine spezielle RNS Struktur ("tRNA-like sequences") enthalten von transgenen Geweben (produzierende Zellen) in nicht-transgene Gewebe (Wildtypzellen) transportiert wird. In gepfropften Pflanzen wird diese Boten-RNS über die pflanzlichen Leitbündel von Blattern in die Blüten und bis in die Antheren (Pollenproduzierendes Gewebe) transportiert. Dort wird die Boten-RNS in ein funktionelles Protein übersetzt. Die Idee dieses Projektes ist es die Cas9 Boten-RNS und die kleine CRSPR RNS mit "tRNA-like sequences" zu fusionieren. Transgene Pflanzen, die diese fusionierten CRISPR/Cas9 RNS produzieren, werden mit Wildtyppflanzen gepfropft und die CRISPR/Cas9 RNS sollten bis in die Blüten transportiert werden und dort aktiv sein. Dadurch werden gezielte Mutationen in den Wildtypgeweben bzw. Zellen eingebracht. Diese Gewebe zeigen die gewünschte Mutation im Genom enthalten aber keine Transgenen Sequenzen. Ein Teil der Nachkommen dieser gepfropften Pflanzen sind daher CRISPR/Cas9 freie stabile Mutante Pflanzenlinien, die die gewünschte Erbgutveränderung zeigen.

(english (Beta))

GO_CRISPR
Use of mobile CRISPR/Cas9 transcripts to produce transgene free mutants in one generation by grafting

Projektbeschreibung (en)

To be able to adapt to fast changing biotic and abiotic stresses imposed by climate change a method to introduce targeted changes in plant genomes in a relative short time span is highly desirable. A lot is known about the function of individual genes in their potential to increase resistance to stress and to confer agronomic desirable traits such as flower timing and fruit quality. The CRISPR/Cas9 system allows targeted changes in the genome such as introduction of point mutations, gene insertions and deletions. Use of CRISPR/Cas9 is based on the production of transgenic plants expressing a sequence specific guide RNA (gRNA) and the Cas9 nuclease, which obviously does not meet the standards of having stable plant lines that are used in agriculture. Such plants also lack consumer's acceptance, as these are genetic modified organisms (GMO). To meet these concerns, breeders have to eliminate the transgenic background - a task which is time consuming and expensive. To address this, we propose to create CRISPR/Cas9 RNA fusion constructs that move in grafted (chimeric) plants from transgenic stock (lower plant part) to non-transgenic wild-type scion tissues. In grafted plants mobile CRISPR gRNA and Cas9 transcripts can introduce targeted mutations in the wild-type scion plant parts forming flowers. These flowers will produce transgene-free seeds that carry the desired mutation(s). By using this approach - mobile CRIS/Ccas9 transcripts combined with grafting - we can produce transgene free mutants within one generation.

In our previous work on messenger RNA (mRNA) transport between plant parts, we have shown that non-cell autonomous fusion transcripts can be created moving in grafted plants from transgenic plant parts to non-transgenic plant parts. After transport into flowers a mobile mRNA is translated into a fully functional protein (Saplaoura and Kragler, 2016; Zhang et al., 2016). We propose to implement these insights to create mobile gRNA and Cas9 mRNA that is delivered from a transgenic root-stock plant to wild-type scions harboring no genetic modification. The CRISPR/Cas9 fusion transcripts traveling to wild-type tissues will introduce targeted mutations in cells harboring wild-type genomes forming flowers and seeds. A fraction of seeds formed on wild-type plants grafted on CRISPR/Cas9 transgenics should harbor the indented genomic mutation(s) but lack transgenic sequences. These CRISPR/Cas9 mutated tissues and plant lines can be relatively easily identified by their phenotype and confirmed by established genomic screening methods. Wild-type tissue grafted onto transgenic CRISPR/Cas9 root-stock are not GMOs and are indistinguishable from natural occurring mutant plant lines. In addition, this approach will significantly shorten the time needed to establish CRISPR/Cas9 mutated transgene free offspring harboring novel or desired traits.

Eckdaten

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Projektlaufzeit

01.07.2018 - 30.06.2020

Förderkennzeichen

031B0538

Fördersumme

Öffentlich: 357.852,00 €
Privat: 0,00 €
Gesamt: 357.852,00 €
Herr Dr. habil. Friedrich Kragler
E-Mail-Kontakt
Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie

Am Mühlenberg 1
14476 Potsdam
Deutschland
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