CROPS OF THE FUTURE

DELITE

Zielsequenz-spezifische Genom-Modifikation von Getreide-Elitematerial durch DNA-integrationsfreie Applikation RNA-vermittelter Endonukleasen im Kontext Haploidie-induzierender Kreuzungen

Koordinator: Dr. Jochen Kumlehn – Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK)

Projektbeschreibung

Das Projekt zielt auf die Erschließung eines neuartigen Prinzips der Übertragung Zielsequenz-spezifischer Endonukleasen, das auf Bestäubung der genetisch zu verändernden Empfängerlinien mit gRNA/Cas9-transgenen, Haploidie-induzierenden Linien beruht. Letztere übertragen gRNA und Cas9 in ihren Spermazellen auf die entstehende Zygote. Während das Genom der Empfängerlinie daraufhin am vorgegebenen genetischen Lokus verändert wird, erfolgt zu Beginn der Embryogenese die Eliminierung des Bestäuber-Genoms einschließlich der darin integrierten Transgene. Im DELITE-Projekt werden wir Hordeum bulbosum und die Maislinie RWK mit gRNA/Cas9-Konstrukten transformieren und mit den daraus resultierenden, Haploidie-indzierenden Linien Gerste bzw. Mais zu bestäuben, die damit Zielsequenz-spezfischen Modifikationen unterzogen werden. Das Konzept hat im Vergleich zu bisher verwendeten Methoden vielfältige Vorteile. (1) Es können nahezu beliebige Genotypen mittels Cas-Endonukleasen verändert werden, da die Bestäubung mit Haploidie-induzierenden Linien wesentlich weniger genotypenabhängig ist als Transformationstechnologie. (2) gRNA/Cas-transgene, Haploidie-induzierende Linien können wahlweise auch in den Labors der Züchter verwendet werden, um genetische Varianten eigener Zuchtlinien zu erzeugen, denn es ist dafür lediglich die zumeist ohnehin gegebene Etablierung von Haploiden- und Genotypisierungstechnologie erforderlich. (3) Anhand einer einzigen gRNA/Cas-transgenen, Haploidie-induzierenden Linie können beliebig viele genetische Varianten bezüglich der adressierten Zielsequenz produziert werden. (4) Da gRNA und Cas-Endonuklease ausschließlich während der frühen Embryogenese präsent sind, ist eine verringerte Modifikation von so genannten off-target Sequenzen zu erwarten. (5) Das gezielt modifizierte Genom bleibt zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens frei von Transgenen. (6) Aufgrund der im Kontext des Verfahrens erfolgenden identischen Verdopplung des modifizierten Genoms besteht die Möglichkeit Pflanzen mit unmittelbar reinerbigen Genvarianten zu erzeugen. 

(english (Beta))

DELITE
Site-directed genome modification of cereal elite material through DNA integration-free delivery of RNA-guided Cas endonuclease via haploidy-inducing crosses

Projektbeschreibung (en)

The DELITE project aims to implement a new concept for the delivery of RNA-guided Cas endonucleases, which involves the use of plant lines capable of inducing the formation of haploid progeny when used as male parent. There are a number of established systems facilitating the formation of maternal haploids via cross-pollination followed by uniparental genome elimination. These include wheat x maize, barley x Hordeum bulbosum and maize x phospholipase A1 knockout (pla1A-KO) maize.
Upon genetic transformation of such haploidy-inducing lines using guide-(g)RNA and Cas expression units, respective transcript and ribonucleoprotein is produced and transferred in their sperm via pollination and fertilization to hybrid zygotes formed on the female parent. While the genome contributed to the zygote by this plant is now subjected to targeted modification, the transgene-carrying genome derived from the haploidy inducer is being completely eliminated in the context of the mitoses taking place in the early zygotic embryo that thereby becomes haploid. Resultant haploid progeny carrying site-specific modifications can be chemically induced to undergo whole genome duplication, which entails the formation of entirely homozygous plants. In the DELITE project, we envisage
to genetically transform Hordeum bulbosum and pla1A-KO maize line RWK using barley and maize target gene-specific gRNA/Cas constructs, respectively. The transgenic, haploidy-inducing lines will then be used to pollinate barley and maize in order to trigger site-directed modifications in these species. The approach pursued has several advantages over current methods.

(1) Site-directed alterations may be achieved in an unprecedented variety of genotypes including elite germplasm, since the use of haploidy-inducing lines is considered far less genotype dependent as compared with conventional methods of plant regeneration from transiently or stably transformed cells.

(2) Once a gRNA/Cas-transgenic haploidy inducer plant is available for a given target gene, it can be readily utilized
for targeted genome modification even in breeders' facilities, where haploid and genotyping technology is typically established.

(3) As cross-pollinations can be performed at virtually unlimited scope, just a single gRNA/Cas-transgenic haploidy
inducer plant is sufficient to generate a whole variety of mutant lines.

(4) The principle is associated with reduced modification of off-targets, because the presence of gRNA and Cas is confined to the period of early embryogenesis.

(5) Thanks to the elimination of the discrete, transgene-carrying genome from the developing embryo, the site-specifically modified genome of the produced plants is kept free from any transgenes during the whole process. (6) The preliminarily haploid genome of these plants is identically duplicated, thus homozygous individuals can be instantly obtained whose genetic modification will be genetically fixed as well.

Eckdaten

CROPS OF THE FUTURE

DELITE

Projektlaufzeit

01.07.2018 - 30.06.2020

Förderkennzeichen

031B0550

Fördersumme

Öffentlich: 436.741,00 €
Privat: 0,00 €
Gesamt: 436.741,00 €
Herr Dr. Jochen Kumlehn
E-Mail-Kontakt
Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK)

Corrensstrasse 3
06466 Gatersleben
Deutschland
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