Sequenzierung - Die Pyrosequenzierung

1996 entwickelten Pal Nyren und Mostafa Ronaghi aus Schweden die Pyrosequenzierung, ein Hochdurchsatzverfahren, mit dem sich die DNA viel schneller und billiger sequenzieren lässt als mit der Methode nach Sanger. Beim Pyrosequenzing wird die DNA-Polymerase durch ein ausgeklügeltes Enzymsystem unter Beteiligung einer Luziferase dabei beobachtet, wie sie ein Nukleotid nach dem anderen an den neusynthetisierten DNA-Strang anhängt. Die zu sequenzierende DNA dient als Matrize und liegt auch hier einzelsträngig vor.

Analog zur Sanger-Sequenzierung verlängert die DNA-Polymerase von einem Primer ausgehend den komplementären DNA-Strang Nukleotid um Nukleotid. Der Einbau eines NTPs wird durch die Luziferase in einen Lichtblitz umgesetzt, der von einem Detektor erkannt und aufgezeichnet wird. Es wird nun nacheinander immer eine der vier Nukleotidsorten zum Ansatz hinzu gegeben. Bei Zugabe des passenden (komplementären) Nukleotids erhält man ein Signal; wurde ein an dieser Stelle nicht passendes NTP zugegeben, bleibt der Lichtblitz aus. Danach werden die vorhandenen NTPs zerstört und eine andere Art wird zugesetzt, dieser Vorgang wird fortgesetzt, bis sich wieder eine Reaktion zeigt.

Die enzymatische Reaktion

Baut die DNA-Polymerase ein komplementäres Nukleodtid erfolgreich ein, wird Pyrophosphat (PPi) freigesetzt. Das Enzym ATP-Sulfurylase wandelt dieses zu Adenosintriphosphat (ATP) um. ATP wiederum treibt die Luziferase-Reaktion an, wodurch Luziferin in Oxyluziferin verwandelt wird. Dies resultiert wiederum in einem detektierbaren Lichtsignal, dessen Stärke proportional zum verbrauchten ATP ist (anschauliche Präsentation des Pyrosequenzing).

Vorteil und Einsatz der Pyrosequenzierung

Ein großer Vorteil der Pyrosequenzierung ist ihre gute Automatisierbarkeit, die sich zur hochparallelen Analyse von DNA-Proben eignet. Auch zur Bestimmung von Einzel-Nukleotid-Unterschieden (Single Nucleotide Polymorphisms = SNPs), die Hinweise z.B. auf Erbkrankheiten geben können, wird die Pyrosequenzierung aufgrund ihrer Lesegenauigkeit häufig eingesetzt.

449 Bewertungen

Bewertung

25825 angesehen