Sequenzierung - SOLiD System von Applied Biosystems

Sequenzier-Methode

Das SOLiD System ähnelt dem 454-Sequenziersystem in der Matrizen-Aufarbeitung und der Sequenzierung. Die Matrizen-DNA wird zunächst fragmentiert und zu ein einem emulsionsartigen PCR-System gegeben. Wie beim 454-Verfahren werden die Matrizen amplifiziert und an sog. DNA-Capture-Beads immobilisiert. Beads mit amplifizierter Matrizen-DNA werden mit Hilfe größerer Polystyren-Beads angereichert, die durch einen Glycerol-Puffer geleitet und anschließend kovalent mit der Oberfläche eines Glasträgers verknüpft werden.

Das SOLiD-System unterscheidet sich maßgeblich von den 454- und vom Genome-Analyzer-Sequenziergeräten, indem es auf der Sequenzierung durch Ligation beruht. Dabei werden 8-basige, mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Oligonukleotide nacheinander mit dem Sequenzierprimer ligiert.

Jede der vier Sonden-Typen trägt einen anderen Fluoreszenzfarbstoff, der an das 3`-Ende gekoppelt ist. Dieser repräsentiert die Matrizensequenz, die komplementär zur vierten und fünften Base der Oligonukleotid-Sonde ist. Hybridisiert die Sonde mit der Matrize, entsteht ein Fluoreszenzsignal, das von einem Laser erfasst wird. Im Anschluss wird die ligierte Sonde zwischen der fünften und sechsten Base gespalten, wodurch der fluoreszierende Teil entfernt wird. Dieser Prozess wird so lange wiederholt, bis eine Leselänge von 35 bis 100 Basenpaaren erreicht ist.