Sequenzierung - 454 Sequencer von Roche

Sequenzier-Methode

Die zu sequenzierende DNA wird zunächst fein zerstäubt. Dabei entstehen doppelsträngige DNA-Fragmente zwischen 300 und 800 Basenpaaren Länge, die der Größe nach sortiert werden. Dann werden zwei verschiedene Oligonukleotid-Adapter an die Fragmente gebunden, die den Primern als Andockstellen für die Strangverlängerung dienen. Einer der Adapter ist biotinyliert, wodurch das Aussortieren einzelsträngiger Fragmente für die weitere Sequenzierung ermöglicht wird. Die Fragmente werden amplifiziert, indem die Matrizen-DNA in einzelne Fragmente aufgeteilt und an 28 µm großen sog. DNA-Capture-Beads in Tröpfchen einer Emulsion immobilisiert wird.

Die PCR-Reaktionen finden in den Tröpfchen statt. Komplementäre Primer, die kovalent an die DNA-Cature-Beads gebunden sind, immobilisieren die PCR-Produkte auf der Oberfläche der Beads. Die mit Matrizen-DNA überzogenen DNA-Capture-Beads werden anschließend in einzelne Wells, die in die Oberfläche eines Lichtleitfaser-Trägers geätzt wurden, geladen.

Die Sequenziermethode basiert auf der Pyrosequenzierung, bei der nach dem Einbau eines passenden Nukleotids durch die DNA-Polymerase über eine Enzymkaskase Licht aus anorganischem Pyrophospaht (PPi) erzeugt wird. Dabei werden die einzelnen Nukleotide über die offenen Wells gespült. Die Anzahl der erzeugten Lichtsignale ist der Anzahl der eingebauten Nukleotide proportional. 

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