Sequenzierung - Genome Analyzer (Solexa) von Illumina

Sequenzier-Methode

Die Sequenziertecknik von Illumina basiert auf der Anheftung zufällig fragmentierter, genomischer DNA-Stücke an eine planare, optische Oberfläche (sog. Flow Cell) und einer anschließenden Festphasen-PCR. Die Adapter bestehen aus Primern für die Amplifikation und aus Sequenzen, die komplementär zu den „Capture Oligos“ auf den Flow Cells sind. Die Länge der Fragmente bestimmt die Grösse der Cluster, die bei der Amplifikation entstehen. Je kleiner desto besser, weil dann mehr Cluster auf der Flow Cell Platz finden und mehr Sequenzen generiert werden können.

Die zu sequenzierenden DNA-Stücke werden in einem ersten Schritt in der Flow Cell mittels Hybridisierung der komplementären Sequenzen eingefangen. In einem zweiten Schritt wird ein antiparalleler Strang des zu sequenzierenden DNA-Moleküls synthetisiert, wobei das Capture Oligo als Primer dient. Die erste Kopie dieser Sequenz dient als Matrize für die weiteren Amplifikationsschritte. Diese erste Kopie hybridisiert wieder an ein komplementäres Oligo auf der Flow-Cell-Oberfläche, welches wiederum als Primer für die nächste Synthese dient. Zu diesem Zeitpunkt liegen zwei komplementäre Kopien der ursprünglichen Sequenz vor, die im Anschluss weiter amplifiziert werden, bis ca. 1000 Kopien des ersten Moleküls erreicht sind. Für eine optimale Cluster Amplification sind Fragmentlängen von 100-500 bp ideal. Im Prinzip mache ich eine Festphasen-PCR.

Nach Abschneiden des komplementären Strangs und Cappen der freien Enden, beginnt der eigentliche Sequenziervorgang einer sehr genauen DNA-Polymerase und in vier verschiedenen Farben markierten Nukleotiden. Dabei fungieren die vier Farben als 3‘-Terminatoren. Pro Zyklus kann nur eine Base von der DNA-Polymerase eingebaut werden. Mittels Fluroeszenz-Mikroskopie wird die eingebaute Base für jeden Cluster bestimmt. Dann wird der Farbstoff abgetrennt, was die Base für den nächsten Synthesezyklus wieder zugänglich macht. Die max. Leselänge hängt ab von der Qualität des Templates, der Effizienz der Polymerase und der Abtrennungs des Farbstoffes ab. Mit der Zeit akkumulieren Fehler, die grössere Leselängen verunmöglichen.

Eine Zusammenfassung und Videoanimation (in englischer Sprache) zum Verfahren finden Sie hier.

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