12.09.2005

Forschung Projekte

Entwicklung markerfreier Gen-Konstrukte und deren Verwendung für die Mikroinjektion

(2001 – 2004) Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und angewandte Ökologie (IME) Abt.Genom- und Proteomforschung, Schmallenberg/Aachen

Thema

Mikroinjektion konnte bisher bei Pflanzen nicht als Transformationsmethode genutzt werden, da bei der Injektion der hohe Innendruck der pflanzlichen Zelle zerstört wurde und dies zum Zelltod führte.

In diesem Projekt sollte die bereits in Vorversuchen getestete Methode erprobt und weiterentwickelt werden. Mit der Anwendung der Mikroinjektion als neue Transformationsmethode sollte es möglich werden, ausschließlich die jeweils funktionell notwendigen Gene ohne Markergen zu übertragen.

Zusammenfassung

Mikroinjektion konnte bei Pflanzen als Transformationsmethode etabliert werden. Dabei erwies sich die Agroinjektion - d.h. Injektion bestimmter Proteine aus Agrobacterium gemeinsam mit den Konstrukten - als erfolgreiche Strategie.

Mittlerweile ist es gelungen, transgene Pflanzen auch ohne Agroinjektion zu erzeugen. Das eröffnet die Möglichkeit, die Mikroinjektion ohne großen Aufwand auch kommerziell zu nutzen.

Es konnten aber bisher nur transgene Pflanzen mit Markergen (Kanamycin-Resistenz) erfolgreich regeneriert werden. Die Verwendung eines Markers ist somit zurzeit noch notwendig.

Versuchsbeschreibung

Das Projekt umfasste mehrere Teilschritte: Zum einen wurden verschiedene Konstrukte für die Mikroinjektion erstellt. Zum anderen wurden die vom Projektpartner (Universität Gießen) injizierten Pflanzenzellen (Mikrokalli) sowie regenerierte transgene Pflanzen molekularbiologisch charakterisiert.

Erstellung von Konstrukten für die Mikroinjektion

Es sollten Konstrukte erstellt werden, die lediglich aus dem gewünschten Gen sowie den Kontrollsequenzen (Promotor und Terminator; „clean-gene„-Fragment) bestehen. Sie sollten keine zusätzlichen Vektorsequenzen aufweisen.

Um die Zuverlässigkeit des Verfahrens und die Transformationsrate zu erhöhen, wurden verschiedene Variationen der Konstrukte getestet: Basierend auf den „clean-gene“- Fragmenten wurden mittels PCR flankierende Erkennungssignale für Restriktionsenzyme eingeführt. Es sollte untersucht werden, ob dadurch die Transformationseffizienz gesteigert wird.

Analog wurden mittels PCR die linken und rechten „Bordersequenzen“ aus Agrobacterium tumefaciens in die Konstrukte eingeführt.

Entwicklung und Erprobung eines Agroinjektionssystems

Parallel zu den zu übertragenden Genen wurden bestimmte Proteine aus Agrobacterium tumefaciens übertragen, die an der Integration der T-DNA in das Pflanzengenom beteiligt sind. Ziel war eine Erhöhung der Transformationsrate.

Für das gleichzeitige Auftreten der „clean gene“-Fragmente und der Proteine wurden zwei Strategien gewählt:

• Der Einsatz der Gene dieser Proteine parallel zu den Konstrukten. Die an der Integration der T-DNA beteiligten Gene wurden aus Agrobacterium isoliert und kloniert.
• Eine Injektion der Proteine gemeinsam mit den Konstrukten. Die Proteine wurden rekombinant hergestellt (in E.coli) und gemeinsam mit den T-DNA-Konstrukten injiziert.

Molekularbiologische Charakterisierung

Aus Einzelzellen nach Agroinjektion wurden unter selektiven Bedingungen Mikrokalli und Pflanzen regeneriert und molekularbiologisch charakterisiert. Zunächst wurden Konstrukte mit einem Markergen (Kanamycinresistenz) injiziert.

Zur Erzeugung transgener Pflanzen ohne Markergen wurden die gewünschten Merkmale ohne Zusatz des Kanamycingens mit Agroinjektion appliziert. Zur Identifikation mikroinjizierter Zellen wurde parallel der nicht toxische Farbstoff Texas Red eingebracht, der sich über längere Zeit im Zellinneren (Vakuole) hält und so die transformierte Zelle markiert. Zellen, die den Farbstoff nicht enthielten, wurden abgetötet.

Ergebnisse

Erstellung von Konstrukten für die Mikroinjektion

Als Reporter-Gen wurde ein Gen für ein fluoreszierendes Protein (gfp) verwendet, dazu ein Gen, das eine Resistenz gegen schädliche Pilze (Verticillum dahliae) vermittelt. Die Konstrukte wurden sowohl mit als auch ohne Markergen hergestellt. Alle Gene wurden unter die Kontrolle des 35S Promotors des Blumenkohlmosaikvirus gestellt. Als Terminationssignal diente der 35S Terminator.

Die Richtigkeit aller Konstrukte wurde mittels Sequenzanalyse überprüft.

Es wurden verschiedene Variationen der Konstrukte getestet.

Entwicklung und Erprobung eines Agroinjektionssystems

Von den unterschiedlichen Strategien (s.o.) erwies sich nur die Agroinjektion als erfolgreich. Für beide Gene (gfp und ver) konnten mehrere unabhängige Pflanzen etabliert werden, wobei die molekulare Analyse des Genoms eindeutig das Vorliegen von Mehrfachintegrationen gezeigt hat. Für jedes Konstrukt konnten mehrere Pflanzen identifiziert werden, die die Gene stabil und in voller Länge beinhalten und die Expression dieser Gene aufweisen.

Molekularbiologische Charakterisierung

Nach erfolgreicher Mikroinjektion der Konstrukte durch den Projektpartner Universität Giessen wurden transgene Pflanzen aus den Mikrokalli regeneriert und molekular analysiert.

Transgene Pflanzen ohne Marker konnten im Projekt nicht regeneriert werden. Es wurden etwa zwanzig Pflanzen pro Konstrukt molekularbiologisch charakterisiert. Es zeigte sich, dass keine die gewünschten Transgene aufwiesen und somit Wildtyppflanzen waren. Bei Nichtverwendung selektiver Medien können transgene Zellen sehr einfach durch Wildtypzellen überwuchert werden, da diese vorab nicht verletzt wurden (Mikroinjektion) und somit zeitlich schneller Kalli ausbilden können.

Auch die Analyse weiterer Mikrokalli und Pflanzen erbrachte keine positiven Ergebnisse, so dass die Verwendung eines Markers zurzeit noch zwingend notwendig ist.

Mittlerweile konnte in Zusammenarbeit mit der Universität Giessen gezeigt werden, dass mit nur geringfügigen Abweichungen in den Parametern die Erzeugung transgener Pflanzen ohne Agroinjektion möglich wird. Nach Verifizierung dieser Modifikationen wäre denkbar, die Mikroinjektion ohne großen Aufwand auch kommerziell zu nutzen.