Die gezielte Insertion von DNS-Sequenzen in das pflanzliche Genom mithilfe moderner Genom-Editierungsmethoden soll untersucht und optimiert werden. Diese Methoden basieren auf RNA-assoziierten Nukleasen (RNPs), die gezielt zu bestimmten DNS-Sequenzen gelotst werden und dort die DNS schneiden. Dieser Doppelstrangbruch (DSB) kann entweder durch einen fehlerbehafteten Reparaturmechanismus entfernt werden, was zu kurzen zufälligen Insertionen oder Deletionen führt, oder durch homologe Rekombination den Einbau eines Reparaturfragments bewirken. Während der fehlerbehaftete Reparaturmechanismus erfolgreich genutzt wird, um z.B. einzelne Gene auszuschalten, ist die gezielte Insertion von DNS-Fragmenten, z.B. zur Regulation der Expression von Genen, derzeit nicht effizient möglich. Das Projekt verfolgt verschiedene Ansätze, mit dem Ziel, die Effizienz des RNA-vermittelten Genom-Editings in Pflanzen zu erhöhen.

Ein spezieller Fokus des Projektes liegt darin, Methoden für das gezielte Knock-in von kurzen, cis-regulatorischen Sequenzen in das Genom zu entwickeln und den Screening-Aufwand, der mit jedem Genom-Editierungsexperiment verbunden ist, zu reduzieren. Im Speziellen sollen folgende Aufgaben adressiert werden: (i) Die Optimierung der Transfektion von RNPs in pflanzliche Protoplasten; (ii) die Applikation von DNA-Reparatur-Fragmenten in räumliche Nähe von durch RNPs induzierten DSBs zur Erhöhung der Knock-in-Frequenzen; (iii) die Evaluation von durch unterschiedlichen Nukleasen herbeigeführten DSBs in Knock-in-Experimenten; und (iv) die Detektion von erfolgreich editierten Zellen bereits auf der Ebene von Protoplasten vor der eigentlichen Kallusbildung oder Pflanzenregeneration. 

In einem Proof of Concept sollen spezifische Insertionen oder Deletionen von cis-regulatorischen Elementen in Promotoren von Zielgenen des Transkriptionsfaktors JUNGBRUNNEN1 (JUB1) herbeigeführt werden. JUB1 wurde in unserem Labor als wichtiger Regulator der Toleranz gegenüber unterschiedlichen abiotischen Stressfaktoren identifiziert, einschließlich Trocken-, Hitze- und Salzstress. Durch Feinregulation der Expression unterschiedlicher JUB1-Zielgene wird es möglich sein, die Stresstoleranz von Pflanzen zu erhöhen, ohne dabei gleichzeitig in Wachstumsprozesse einzugreifen, einem wichtigen züchterischen Ziel.