Das “clustered regularly interspaced short palindromic repeat” (CRISPR) -assoziierte Protein 9 (Cas9) -Genom-Editiersystem (CRISPR / Cas9) wurde aus dem prokaryotischen Typ-II-adaptiven Immunitätssystem abgeleitet. Diese bahnbrechende Technologie wurde in Pflanzen weitverbreitet eingesetzt, um Genommodifikationen zur Verbesserung von Pflanzeneigenschaften zu erzielen. In den meisten Fällen wurden CRISPR / Cas9-DNA-Konstrukte verwendet, die durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelten T-DNA-Transfer oder biolistischen Partikelbeschuss
in Pflanzen eingebracht wurden. Während dieses Prozesses ist es jedoch sehr wahrscheinlich, dass CRISPR / Cas9-Konstrukte in das Genom integrieren. Daher wurden DNA-freie Methoden zur Genom-Editierung entwickelt, die eine
Protoplasten-Transfektion mit Cas9 / sgRNA-Ribonukleoprotein-Komplexen verwenden. Der Protoplastenansatz setzt jedoch umfangreiche Gewebekulturarbeiten für die Regeneration von Pflanzen voraus, die oft die gewünschten Mutationen zusammen mit unerwünschten Ereignissen von somaklonaler Variation tragen.

In diesem Vorhaben verfolgen wir das Ziel, ein DNA-freies Genom-Editierverfahren zu entwickeln, das auch ohne Gewebekultur funktioniert. Wir haben bereits eine Hochdrucksprühmethode entwickelt, um RNA-Moleküle effizient in Pflanzenblätter und meristematisches Gewebe einzuführen (Dalakouras et al., 2016). Mit dieser Technik wollen wir Cas9 / sgRNAs entweder als Ribonukleoprotein-Komplexe oder als reine RNA-Mischung in das apikale Sprossmeristem (SAM) einer grün fluoreszierenden Protein (GFP) -exprimierenden Tomatenpflanze einbringen.
Bisher wurde der Transport des Cas9-Proteins durch Einfügen von Kernlokalisierungssignale (NLS) in die Cas9-codierende Region in den Kern eukaryotischer Zellen gewährleistet. In unserem innovativen Ansatz werden wir
zusätzlich RNA-Motive verwenden, die den Transport von sgRNAs in den Zellkern erleichtern. Darüber hinaus werden wir Lipid-Doppelhydroxid (LDH)-Nanoschichten verwenden, um den Cas9 / sgRNA-Komplex zu stabilisieren und
seine Aufnahme durch Pflanzenzellen zu verbessern. Beim Hochdrucksprühen wird das Genom-Editieren (hier das Editieren des GFP-Transgens) u.a. auch in SAM-Zellen stattfinden. Einige der sich aus dem SAM entwickelnden Blätter und Seitenzweige werden die gewünschten Mutationen tragen, was sich durch die Inaktivierung der GFP-Expression unter UV-Licht verfolgen lässt. Nach Selbstbestäubung der Blüten an mutierten Zweigen sollten Samen produziert werden, die die Mutation tragen. Somit werden in der nächsten Generation auch einige der Nachkommen die gewünschte Mutation stabil tragen. Die hier vorgeschlagene Methode könnte für die Pflanzenzüchtung von großer Bedeutung sein. Es ist vorstellbar, dass das DNA- und Gewebekultur-freie Genomeditieren den Weg für die Mutagenese von schwer regenerierbare Pflanzensorten und wahrscheinlich auch von Holzpflanzen ebnen wird.