Die Genom-Editierung mittels gezielt designter Nukleasen – Enzyme mit der Fähigkeit Nukleinsäuren gezielt zu schneiden – hat die Möglichkeiten im Bereich der Pflanzenzüchtung revolutioniert. Ein immer noch bestehendes Grundproblem dieser Technologie ist allerdings der effiziente und sichere Transfer dieser molekularen Werkzeuge in die Pflanzenzellen. Laser-basierte Verfahren können hier eine Alternative mit zahlreichen Vorteilen darstellen. Das vorgestellte Projekt befasst sich daher mit dem Einsatz eines innovativen Laser-basierten Optoporationsverfahrens für den Transport von CRISPR/Cas9 Ribonukleoprotein-Komplexen (bestehend aus einer Nuklease und einer Sequenzspezifität-vermittelnden RNA) durch Permeabilisierung der Zellmembran von zellwandlosen Kartoffelprotoplasten. Dieser Ansatz erlaubt die Genom-Editierung von unterschiedlichen Bereichen in der DNA einzelner Protoplasten und somit das systematische Screening von Genotypen von individuellen Abkömmlingen. Das Laser-basierte Verfahren bietet hierbei ein unübertroffenes Sicherheitsprofil für den Genom-Editierungsprozess. Aufgrund der berührungsfreien und rein physikalischen Permeabilisierung der Protoplasten, wird das Risiko toxischer Nebeneffekte z.B. durch verwendete Chemikalien drastisch reduziert. Zudem kann komplett auf das Einbringen transgener DNA (z.B. T-DNA, virale Replikons) verzichtet werden, was einen deutlichen Vorteil in Hinblick auf die regulatorischen Aspekte solcher Pflanzen bietet. Im Rahmen des Projektes werden robuste Protokolle für die Herstellung von Kartoffelprotoplasten, die Laser-basierte Genom-Editierung der Protoplasten sowie für die anschließende Regeneration von vollständigen Pflanzen aus den Protoplasten etabliert.

Das Projekt wird in Form einer Kooperation zwischen der Abteilung Industrielle und Biomedizinische Optik des Laser Zentrum Hannover e.V. (LZH) und dem Institut für Pflanzengenetik der Leibniz Universität Hannover durchgeführt, wobei die Projektpartner die jeweilige Expertise aus ihrem Fachgebiet einbringen. Das Institut für Pflanzengenetik wird hierbei die Konzipierung und Synthese der CRISPR/Cas9 Komplexe, Gewinnung der Protoplasten, Screening der Genotypen und Regeneration der Kartoffelpflanzen umsetzen. Die Optimierung der Parameter für die Optoporation der Protoplastenmembran erfolgt durch das LZH. Hierbei werden die Überlebensraten der Protoplasten sowie die Effizienz, mit der die CRISPR/Cas9

Ribonukleoprotein-Komplexen in die Zellen eingebracht werden können, als relevante Faktoren untersucht. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse werden für die Miniaturisierung sowie Automatisierung des Laser-basierten Verfahrens Anwendung finden. In der Folge ist damit eine Applikation der eingesetzten Methode auf eine große Anzahl vereinzelter Protoplasten möglich, welche durch die Entwicklung eines technischen Demonstrators auch in den Anwenderlaboren getestet werden soll.

Während der ersten Projektphase, konnten erfolgreich die Protokolle zur Generierung von Kartoffelprotoplasten etabliert und die Regeneration zu vollständigen Pflanzen demonstriert werden. Zu dem liegen nun seitens der Leibniz Universität Hannover Reporterkonstrukte vor, mit denen es möglich ist, eine erfolgreiche Genom-Editierung durch die eingebrachten CRISPR/Cas9 Ribonukleoprotein-Komplexe durch rein visuelle Beobachtungen sichtbar zu machen. Bei den hierfür eingesetzten Reportergenen – kodierend für die Proteine β-Glucuronidase (GUS) bzw. GFP – wurde eine Leseraster-Verschiebung eingefügt, welche die Reportergene inaktiviert. Durch das spezifische Schneiden der Zielsequenzen durch die eingebrachten Genscheren wird diese Verschiebung aufgehoben und das Genprodukt kann wieder synthetisiert werden. So lassen sich erfolgreich editierte Kartoffelzellen einfach durch eine blaue Färbung bzw. grüne Fluoreszenz identifizieren. Des Weiteren konnten auch die Sequenzspezifität-vermittelnden RNAs für die CRISPR/Cas9 Ribonukleoprotein-Komplexe entworfen werden, welche vier Gene im Glycoalkaloid-Biosyntheseweg von Kartoffelpflanzen binden, so dass ein Ausschalten dieser erfolgt und bestimmte giftige Inhaltsstoffe (Solanin) von den Pflanzen nicht mehr gebildet werden können.

Durch das LZH konnte parallel die Wirkung der Laser-basierten Technik auf die Protoplasten erfolgen und eine Beeinflussung der Vitalität mit einem Resazurin-Test ermittelt werden. Dieser Test misst das Reduktionspotential und metabolische Aktivität der Protoplasten als Indikator für die Lebensfähigkeit. Da für die Permeabilisierung der Zellmembran bei dieser Technologie Goldnanopartikel als Mediatoren dienen, wurden mehrere Verfahren – z.B. der Einsatz von Linker-Molekülen oder –Proteinen – untersucht, die ein stärkeres Binden der Goldnanopartikel bewirken bzw. eine größere Nähe dieser beiden Komponenten gewährleisten. Als weiterer Schritt im Projekt konnte die Konstruktion und der Aufbau des technischen Demonstrators realisiert werden, so dass im nächsten Schritt ein Transfer der Technologie in das Anwenderlabor erfolgen kann.