CrispyApple
CROPS OF THE FUTURE


Entwicklung einer Methode zur Modifizierung des Apfelgenoms mittels CRISPR/Cas9-Technologie in Kombination mit Biolistik

Koordinator: Frau Dr. Bastienne Brauksiepe – (Institut)

Projektbeschreibung

In diesem Projekt werden zwei innovative Methoden (CRISPR/Cas und Biolistik) kombiniert, um eine effektive Methode zur Modifikation des Apfelgenoms zu entwickeln. Eine derartige Methodik kann sowohl für die Forschung zur Entschlüsselung von Genfunktionen als auch für die Züchtung von Interesse sein.

Es wird ein System zur transienten Transformation von Pflanzen entwickelt, indem Plasmide mit CRISPR/Cas-Konstrukten mit hoher Geschwindigkeit in Pflanzenzellen eingebracht werden. Nach deren Regeneration erhält man Pflanzen, welche transient mit CRISPR/Cas-Konstrukten transformiert sind, deren Expression zu genetischen Modifikationen führt, welche aber möglichst keine Fremd-DNA im Genom integriert haben. In DNA-freien Versuchsansätzen sollen Ribonukleoproteine (RNPs = Cas-Protein + “guide-RNA“) zum Einsatz kommen. Hierdurch wird das Risiko der Integration von Fremd-DNA ins Ziel-Genom eliminiert. Weiterhin sollen guide-RNAs und Cas-RNAs verwendet werden, um eine DNA-freie Genommodifikation zu erzielen und mögliche Limitierungen der Biolistik, bedingt durch die Proteingröße, zu vermeiden.

Ausgangsmaterial für die Versuche sind in vitro-Kulturen von unterschiedlichen Apfelgenotypen. Diese Genotypen tragen ein Reportergen, dessen gezielte Inaktivierung durch den Verlust einer Farbreaktion leicht nachzuweisen ist. Durch drei verschiedene Herangehensweisen (mittels Plasmiden, mittels moderner RNPs und mittels RNAs) soll das Genom spezifisch modifiziert werden. Hierfür müssen entsprechende Vektoren konstruiert und spezifische und effektive guide-RNAs ermittelt und in-vitro produziert werden. Der Transfer mittels Biolistik muss durch Anpassung der physikalischen Parameter optimiert werden. Nach Regeneration der Pflanzen wird die gerichtete Genommodifikation durch Sequenzanalysen (PCR, Southern Blot, Sequenzierung, hochauflösende Schmelzkurvenanalysen, Heteroduplexanalysen mittels Kapillarelektrophorese) verifiziert.


Development of a biolistic-mediated CRISPR/Cas system as an effective genetic engineering method to target DNA at specific locations in the apple genome

Coordinator: Frau Dr. Bastienne Brauksiepe – (Institut)

Project description

In this project we will combine two innovative methods (CRISPR/Cas and biolistics) to provide a tool for genome editing in apple trees. The biolistic approach should result in a much broader spectrum of susceptible genotypes while the approach using CRISPR/Cas enables us to specifically modify only targeted genes without integration of foreign DNA. Such systems would prove very useful in research (e.g. identification of gene functions) and commercial breeding (targeted gene editing). We aim to establish a system for transient transformation of plants delivering plasmids carrying CRISPR/Cas constructs by biolistics. Biolistics introduce those constructs into target plant tissues by accelerating DNA-coated microparticles at high velocity. We expect to be able to regenerate plants transiently transformed with CRISPR/Cas-constructs the expression of which should lead to genetically modified plants not containing permanently integrated foreign DNA. Also, we will attempt to modify the described technique in order to further minimize the possibility of introducing foreign DNA into the target genome. In these DNA-free approaches we will prepare ribonucleoproteins (RNPs, consisting of CRISPR/Cas proteins and target specific guide-RNAs). These RNPs shall also be delivered into the target tissues using the biolistic approach. This approach should also lead to genetically edited plants completely eliminating the risk of integrating any foreign DNA into the targets genome. We will also try to achieve DNA-free genome editing by simultaneously introducing guide- and Cas-RNAs without relying on preformed proteins. Thus, we aim to avoid possible restrictions of the biolistic methods due to, for instance, protein size. We aim to modify the genome of apple at specific sites using modern CRISPR/Cas technology by different ways of using CRISPR/Cas reagents (common plasmid-based, modern RNPs and innovative RNA:RNA).

Plant tissue cultures of different apple genotypes will be used. Those genotypes already carry a reporter gene inactivation of which using CRISPR-mediated modification can easily be tracked by the loss of a staining reaction. Different vectors have to be constructed, specific and und effective guide-RNAs have to be designed and in-vitro produced. For a successful development of a biolistic-mediated CRISPR/Cas system many physical parameters have to be considered and optimized. Regenerated plants will be tested for modifications using sequence-related analyses (PCR, Southern Blot, Sanger sequencing, high resolution melting analyses, hetero duplex analyses using capillary electrophoresis).

Projektpartner

Herr Dr. Bastienne Brauksiepe

Hochschule Geisenheim University


Von-Lade-Straße 1

65366 Geisenheim


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